Plantas transgénicas
Introducción
¿Por qué plantas transgénicas?
La producción de plantas transgénicas permite modificar
el aspecto de los frutos y las verduras, de decidir su época
de maduración, modificar su valor nutritivo, hacerlos
resistente a los herbicidas, a los suelos pobres ó ingratos,
a las enfermedades.
Desearíamos también crear plantas capaces de producir
anticuerpos y vacunas.
totipotencia de las Células.
En el reino vegetal, cualquier
célula puede dar origen a toda la planta. Para cultivar
las células ahora conocemos medios diferentes. Para hacerlas
multiplicarse poseemos citoquininas vegetales.
Sistemas de transformación
de plantas
actualmente se conocen tres
técnicas
1. Transformación de protoplastos
2. Transformación biolística (o bombardeo de microproyectiles)
3. Transformación mediante Agrobacterium
1. Transformación de
protoplastos
La célula vegetal a
la que se le quitó la pared lleva el nombre de protoplasma.
Para separar las células, se utilizan medios físicos.
Luego, para quitar la pared de las células, se utilizan
enzimas como el celulasa y el pectinasa. Por ejemplo, se pueden
obtener protoplastos petunia a partir de hojas, mediante la retirada
de la epidermis (medio físico) y el tratamiento con celulasas
y pectinasas (enzimas) en medio isotónico.
Los protoplasmas así liberados
son puestos en suspensión en un medio de cultivo. Los
protoplastos se mantienen en un medio de cultivo y se adiciona
el gen o el plásmido que se ha de transferir. Para conseguir
la penetración de este ADN es necesaria la permeabilización
de la membrana, que se lleva a cabo mediante distintos procesos:
a. Electroporación: Se aplican descargas eléctricas
que hacen poros en las membranas de los protoplasmas. El ADN
del medio penetra por estos hoyos.
b. Tratamiento con polietilenglicol para desestabilizar la membrana
de las protoplasmas.
c. La utilización de liposomas.
d. Los métodos al calcio.
|
Los protoplasmas son multiplicados en
condiciones que permiten regenerar la planta. Las plantas nacidas
de protoplasmas recombinados son seleccionadas. La planta que
incorporó un gen de resistencia a un herbicida es seleccionada
en un medio que contiene este herbicida.
2. Transformación bio-balística
El ADN puede ser introducido en una célula
por microproyectiles de 10 µm de diámetro. Estos
proyectiles, a menudo en tungsteno son recubiertos con el ADN
que hay que introducir.
3. Transformación con Agrobacterium
tumefaciens
La fabricación de transgén
de dicotiledóneas a menudo se hace co-cultivando células
o tejidos que provienen de estas plantas con A. Tumefaciens.
Este método no es utilizable con monocotiledóneas
(el maíz y el arroz, etc.). Las bacterias del género
Agrobacterium son patógenas de las plantas dicotiledóneas.
Producen tumores. Estas bacterias penetran en los espacios intercelulares
por las pequeñas heridas presentes sobre la superficie
de la planta. A. Tumefaciens es atraída por las
sustancias que las células de la planta secretan en esos
lugares.
El tumor se forma después de que la bacteria ha transmitido
al núcleo de células de la planta una secuencia
de ADN presente sobre un plásmido (el Ti plásmido)
de A. Tumefaciens, el T-ADN. La secuencia contiene cuatro
genes que son integrados en un cromosoma de la celda (célula)
vegetal. La bacteria coloniza así la planta, forzándola
a producir una sustancia nutritiva para la bacteria. La sustancia
y las bacterias son localizadas en el tumor.
El estudio del Ti plásmido permitió
descubrir genes de virulencia y genes que inducen el tumor. Este
conjunto de genes es flanqueado, a la derecha y a la izquierda,
por secuencias especificas de nucleótidos.
El Ti plásmido es aislado. Los
genes patológicos que contiene son suprimidos, pero las
secuencias específicas que rodean estos genes son mantenidas.
Entre las secuencias específicas, inserta el gen que quiere
transferir a la planta. Transformamos A. Tumefaciens con
plásmido recombinado.
Después de la transformación
de Agrobacterium por el plásmido recombinado, se
cocultivan las células de la planta con las de las bacterias.
Para inducir la introducción del plásmido recombinado,
estimulamos la bacteria, cultivándola con tejidos heridos
que provienen de hojas o tallos.
|
Un protoplasto vegetal es la parte de la célula vegetal que está
delimitada e incluída dentro de la pared celular y que
puede ser plasmolisada y aislada por eliminación mecánica
o enzimática de la pared celular. El protoplasto es por
lo tanto una célula desnuda, rodeada por su membrana plasmática,
potencialmente capaz de regenerar la pared celular, crecer y
dividirse.
El pionero en el aislamiento de protoplastos fue Kiercker, que
consiguió en 1892 obtener los primeros protoplastos por
métodos quirúrgicos, complejos y poco eficaces.
Hubo que esperar 68 años hasta que Cocking (1960) demostró
la posiblidad de aislar por métodos enzimáticos
grandes cantidades de protoplastos viables. Una vez establecida
la eficacia del método enzimático y su enorme superioridad
sobre el método quirúrgico, la técnica ha
sido objeto de multiples refinamientos y ajustes, siendo aplicada
a multitud de especies vegetales con diverso éxito.
http://www.encuentros.uma.es/encuentros34/protop34.html
|
El aislamiento de protoplastos
depende en gran medida del tipo y concentración de los
enzimas utilizados. Los dos enzimas esenciales son la celulasa
y la pectinasa, que degradan específicamente los componentes
celulósicos y pectínicos de la pared celular. Algunos
tejidos también requieren hemicelulasas adicionales para
una correcta digestión de la pared. Otros preparados enzimáticos
como la driselasa desarrollan un conjunto de actividades líticas:
celulasas, laminarinasas, xilanasas, pectinasas. Todos los preparados
enzimáticos incluyen impurezas, como nucleasas y proteasas,
que pueden tener un efecto negativo sobre la viabilidad celular.
Los enzimas son pH dependientes (4-6) y su temperatura óptima
de actuación es de 40 a 60°C. Debido a la fragilidad
osmótica de los protoplastos, es necesario controlar perfectamente
el potencial osmótico tanto de la solución enzimática,
como de la solución de lavado y de la solución
de recuperación y cultivo de los protoplastos. Para ello
se usan osmóticos iónicos o no iónicos como
sorbitol, manitol, sacarosa, glucosa, cloruro cálcico,
etc, a distintas dosis.
|
Agrobacterium and crown gall
disease http://www.esf.edu/efb/course/EFB530/lectures/agrobact.htm
Agrobacterium causes Crown gall disease.
This disease occurs when the soil bacterium Agrobacterium
tumefaciens enters a stem through a wound site (crown is
the stem just above the soil surface).
This causes proliferation of tissue, like cancer growth (gall)
and can occur on many dicot species (grape, fruit and nut trees
etc.).
Does this have to do with hormones?
One can heat a gall to 42C, kills Agrobacterium, but not
plant cells, gall continues to grow and proliferate even in absence
of bacteria.
The gall tissue cells can divide and grow on tissue culture medium
without hormones (they have no requirement for auxin or cytokinin)
The gall tissue contains abnormally high amounts of auxin and
cytokinin and have the machinery to synthesize those hormones
This machinery is gained by the stable transfer of genes
from Agrobacterium to the infected plant cells.
Agrobacterium
transfer DNA into the plant cells.
The DNA from the bacterium is integrated into a plant chromosome.
The transferred DNA (T-DNA) is a portion of a large plasmid.
In Agrobacterium tumefaciens, this is the Ti (tumor
inducing) plasmid.
The T-DNA includes genes for enzymes involved
in IAA (indole acetic acid), cytokinin, and opine biosynthesis.
Two genes, iaaM and iaaH, encode enzymes for the
production of IAA, one gene, iptZ, encodes an enzyme for
the production of cytokinin. These genes are different from the
plant genes for hormone synthesis enzymes These genes on the
bacterial Ti plasmid have eucaryotic plant-type promoters
another gene encodes octopine synthetase, an enzyme for the production
of the opine, octopine, a modified amino acid
The overproduction of hormones causes
cell proliferation, while the opine produced serves as a source
of nitrogen for the bacterium, but not for the plant.
Mutations in individual genes of the T-DNA can cause different
types of tumors to grow.
|
Mutations in the iaa genes result in shooty tumors whereas
mutations in the ipt gene causes rooty tumors.
Agrobacterium or the Ti plasmid and plant transformation
A recombinant plasmid:
The genes for hormone and opine synthesis are removed from the
Ti plasmid and are replaced with a selectable marker,
a gene which allows for growth of only transformed cells, usually
a drug- or herbicide-resistance gene (e.g, kanamycin resistance).
One can also add in another gene, from any source, as long as
it has a plant promoter (such as herbicide resistance, insecticidal
proteins, vitamin synthesis, etc.)
in a bacteria:
Agrobacterium is transformed with this modified plasmid.
Leaf disks are dip in a suspension of the Agrobacterium. The
bacterium transfers the T-DNA with these genes into the plant
cells and the genes become integrated into the plant chromosome
selection:
the leaf disks are placed on tissue culture medium with the drug,
so only drug-resistant cells grow with the appropriate addition
of hormones, leaf cells can grow and eventually develop into
shoots and roots, regenerating a whole plant that is transgenic.
Biolistic transformation
Agrobacterium-mediated
transformation is only effective among plants that the bacterium
can infect This includes most dicots. Monocots (like maize, rice,
and wheat) are not susceptible to Agrobacterium and have
not been effectively transformed this way.
Instead, one may coat gold or tungsten
particles with DNA, then "shoot" these into plant tissue.
At a low frequency, this DNA is integrated into the plant chromosome,
allowing for transformation of species that have not worked with
Agrobacterium
Pictures:
http://anka.livstek.lth.se:2080/microscopy/Agrobact.htm
|
Question - What can you tell
about the Ti Plasmid?
------------------------------------------------
This plasmid is named for a plasmid found in a bacteria called
Agrobacter tumefaciens. It causes "plant cancer"
or what are known as galls. They are little tumors in which the
bacteria can grow and live in the plant. Ti stands for tumor
inducing. The bacterium gets into the plant through some kind
of wound, ie.
a scratch. It injects its plasmid into a plant cell and the plasmid
inserts its DNA into the plant's DNA. Then the DNA directs the
plant to make a hollow tumor where the bacteria can live. Scientists
have taken advantage of this plant's ability to insert foreign
DNA into another plant.
|
They take the genes out of the plasmid
that cause galls and insert genes of interest, ie. genes for
pest resistance and let the plasmid carry those genes into the
plant. The plant will start making the product you want. You
may have seen a picture of a tobacco plant glowing because firefly
genes for glowing were inserted into the plant. They did this
so they could know if the gene had made it into the plant. Once
they are sure the gene they want has made it into the plant,
they clone the plant cells. By the way, plant tissue culture
is a procedure that is very common and has been done for years,
this is not the same as cloning animals.
Van Hoeck
|
Selección de transformantes
El rendimiento de la operación
siempre es débil. Hay que escoger el pequeño número
de plantas que expresan el transgén y eliminar todos los
otros. Para la selección, lo más simple es utilizar
un gen de resistencia a un antibiótico ó a un herbicida.
Este gen es insertado en el plásmido. Si las células
son cultivadas en un medio que contiene el antibiótico
o el herbicida las células que incorporaron el plásmido
serán las únicas que sobreviven.
Este método es muy controvertido,
porque acaba en una diseminación de los genes de resistencia
ya sea a los antibióticos, o ya sea a los herbicidas.
La transmisión horizontal de los genes ha sido demostrada.
La diseminación de los genes no puede ser controlada.
Se tienen que reemplazar estos métodos.
Actualmente se incorporan al plásmido,
genes que permiten la utilización de otras fuentes de
carbono que las utilizadas por la célula. Sólo
sobrevivirán en presencia de esta fuente, las células
que contiene el plásmido que lleva el gen selectivo.
Es muy importante conocer el modo en el
que las células han sido seleccionadas para decidir la
aceptación de un transgène.
Ejemplos de plantas transgénicas
1. Resistencia a herbicidas
La resistencia a los herbicidas es conferida
por genes de resistencia descubiertos en ciertas bacterias ó
en ciertas plantas como las petunias. Ahora, tenemos soja, colza
y algodón transgénicos.
La resistencia a los herbicidas simplifica
el control de las malas hierbas en el momento de la cultura.
Hasta el día cuando la resistencia será transmitida
también a las malas hierbas.
2. Resistencia a plagas y enfermedades
El Bacilo thurigiensis exprime una proteína
tóxica para muchos insectos, pero no para otros organismos.
El gen que codifica esta proteína ha sido introducido
en ciertas plantas. El fin es el de disminuir el consumo de insecticidas.
|
Se estudia la resistencia a los virus.
Lo que permitiría proteger los cultivos de tabaco, de
papas, de tomates, de calabacines, etc. Pero todo aquí
está al punto de ensayos. Sería interesante medir
el tiempo, ó cuánto hace falta hasta que los insectos
y el virus se vuelvan resistentes a las técnicas utilizadas.
3. Mejora de las propiedades nutritivas y organolépticas
El conocimiento del metabolismo de las plantas permite
mejorar y presentar mejoramientos de sus características.
Por ejemplo en el tomate mejoramos la textura y la coherencia
del fruto. También se controla el proceso de madurez.
4. Resistencia a estrés ambiental
La productividad de muchos
cultivos es comprometida por la gran variedad de presiones ecológicas,
como la sequedad, las heladas, etc. La resistencia en las condiciones
desfavorables es controlada por varios genes. Es difícil
de obtener ahora un medio transgénico de crearlas.
Un ejemplo de mejoramiento de la resistencia
de una planta a las heladas ha sido efectuado por medio de Pseudomonas
syringae y Erwinia herbicola. El hábitat
natural de estas bacterias son las plantas.
Estas bacterias son responsables de daños
de geles sobre muchas verduras. Facilitan la producción
de los cristales de hielo a partir de una proteína que
actúa como núcleo de cristalización. La
separación del gen que codifica esta proteína permite
conseguir colonias de estas bacterias que, una vez inoculada
en grandes cantidades en la planta le confieren una resistencia
más grande sobre las temperaturas bajas.
5. Otras aplicaciones
En horticultura se han podido
conseguir variedades de colores normalmente imposibles y que
hubo que obtener por medio de cruzamientos ó de hibridizaciones.
Se han obtenido así rosas azules (terribles) introduciendo
un gen de petunia responsable de la síntesis del pigmento
responsable del color azul (terrible).
También se ha producido un plástico
biodegradable por medio de las plantas en las cuales se han insertado
los genes que codifican el poli - b-hidroxibutirato.
Finalmente, también plantas transgénicas
"posiblemente" serán desarrolladas para producir
vacunas contra el tétanos, la malaria etc. (a partir de
plantas como el plátano, la lechuga ó el mango).
|
