biologia molecular, Cochabamba, Bolivia, abril 2006
Plantas transgénicas
Jean-Pierre HERVEG* y Maritza BARCIA-MACAY**
*Université de Louvain, Unité GECE, Christian de DUVE Intitute of cellular Pathology (ICP), Brussels, Belgium.


plan.
1. microorganismos transgénicos
2. Plantas transgénicas
3. Animales transgénicos

a continuación


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Plantas transgénicas

Introducción

¿Por qué plantas transgénicas?
La producción de plantas transgénicas permite modificar el aspecto de los frutos y las verduras, de decidir su época de maduración, modificar su valor nutritivo, hacerlos resistente a los herbicidas, a los suelos pobres ó ingratos, a las enfermedades.
Desearíamos también crear plantas capaces de producir anticuerpos y vacunas.

totipotencia de las Células.
En el reino vegetal, cualquier célula puede dar origen a toda la planta. Para cultivar las células ahora conocemos medios diferentes. Para hacerlas multiplicarse poseemos citoquininas vegetales.

Sistemas de transformación de plantas

actualmente se conocen tres técnicas

1. Transformación de protoplastos
2. Transformación biolística (o bombardeo de microproyectiles)
3. Transformación mediante Agrobacterium

1. Transformación de protoplastos
La célula vegetal a la que se le quitó la pared lleva el nombre de protoplasma. Para separar las células, se utilizan medios físicos. Luego, para quitar la pared de las células, se utilizan enzimas como el celulasa y el pectinasa. Por ejemplo, se pueden obtener protoplastos petunia a partir de hojas, mediante la retirada de la epidermis (medio físico) y el tratamiento con celulasas y pectinasas (enzimas) en medio isotónico.

Los protoplasmas así liberados son puestos en suspensión en un medio de cultivo. Los protoplastos se mantienen en un medio de cultivo y se adiciona el gen o el plásmido que se ha de transferir. Para conseguir la penetración de este ADN es necesaria la permeabilización de la membrana, que se lleva a cabo mediante distintos procesos:

a. Electroporación: Se aplican descargas eléctricas que hacen poros en las membranas de los protoplasmas. El ADN del medio penetra por estos hoyos.
b. Tratamiento con polietilenglicol para desestabilizar la membrana de las protoplasmas.
c. La utilización de liposomas.
d. Los métodos al calcio.

Los protoplasmas son multiplicados en condiciones que permiten regenerar la planta. Las plantas nacidas de protoplasmas recombinados son seleccionadas. La planta que incorporó un gen de resistencia a un herbicida es seleccionada en un medio que contiene este herbicida.

2. Transformación bio-balística

El ADN puede ser introducido en una célula por microproyectiles de 10 µm de diámetro. Estos proyectiles, a menudo en tungsteno son recubiertos con el ADN que hay que introducir.

3. Transformación con Agrobacterium tumefaciens

La fabricación de transgén de dicotiledóneas a menudo se hace co-cultivando células o tejidos que provienen de estas plantas con A. Tumefaciens. Este método no es utilizable con monocotiledóneas (el maíz y el arroz, etc.). Las bacterias del género Agrobacterium son patógenas de las plantas dicotiledóneas. Producen tumores. Estas bacterias penetran en los espacios intercelulares por las pequeñas heridas presentes sobre la superficie de la planta. A. Tumefaciens es atraída por las sustancias que las células de la planta secretan en esos lugares.

El tumor se forma después de que la bacteria ha transmitido al núcleo de células de la planta una secuencia de ADN presente sobre un plásmido (el Ti plásmido) de A. Tumefaciens, el T-ADN. La secuencia contiene cuatro genes que son integrados en un cromosoma de la celda (célula) vegetal. La bacteria coloniza así la planta, forzándola a producir una sustancia nutritiva para la bacteria. La sustancia y las bacterias son localizadas en el tumor.

El estudio del Ti plásmido permitió descubrir genes de virulencia y genes que inducen el tumor. Este conjunto de genes es flanqueado, a la derecha y a la izquierda, por secuencias especificas de nucleótidos.

El Ti plásmido es aislado. Los genes patológicos que contiene son suprimidos, pero las secuencias específicas que rodean estos genes son mantenidas. Entre las secuencias específicas, inserta el gen que quiere transferir a la planta. Transformamos A. Tumefaciens con plásmido recombinado.

Después de la transformación de Agrobacterium por el plásmido recombinado, se cocultivan las células de la planta con las de las bacterias. Para inducir la introducción del plásmido recombinado, estimulamos la bacteria, cultivándola con tejidos heridos que provienen de hojas o tallos.


Un protoplasto vegetal es la parte de la célula vegetal que está delimitada e incluída dentro de la pared celular y que puede ser plasmolisada y aislada por eliminación mecánica o enzimática de la pared celular. El protoplasto es por lo tanto una célula desnuda, rodeada por su membrana plasmática, potencialmente capaz de regenerar la pared celular, crecer y dividirse.

El pionero en el aislamiento de protoplastos fue Kiercker, que consiguió en 1892 obtener los primeros protoplastos por métodos quirúrgicos, complejos y poco eficaces. Hubo que esperar 68 años hasta que Cocking (1960) demostró la posiblidad de aislar por métodos enzimáticos grandes cantidades de protoplastos viables. Una vez establecida la eficacia del método enzimático y su enorme superioridad sobre el método quirúrgico, la técnica ha sido objeto de multiples refinamientos y ajustes, siendo aplicada a multitud de especies vegetales con diverso éxito.

http://www.encuentros.uma.es/encuentros34/protop34.html
El aislamiento de protoplastos depende en gran medida del tipo y concentración de los enzimas utilizados. Los dos enzimas esenciales son la celulasa y la pectinasa, que degradan específicamente los componentes celulósicos y pectínicos de la pared celular. Algunos tejidos también requieren hemicelulasas adicionales para una correcta digestión de la pared. Otros preparados enzimáticos como la driselasa desarrollan un conjunto de actividades líticas: celulasas, laminarinasas, xilanasas, pectinasas. Todos los preparados enzimáticos incluyen impurezas, como nucleasas y proteasas, que pueden tener un efecto negativo sobre la viabilidad celular. Los enzimas son pH dependientes (4-6) y su temperatura óptima de actuación es de 40 a 60°C. Debido a la fragilidad osmótica de los protoplastos, es necesario controlar perfectamente el potencial osmótico tanto de la solución enzimática, como de la solución de lavado y de la solución de recuperación y cultivo de los protoplastos. Para ello se usan osmóticos iónicos o no iónicos como sorbitol, manitol, sacarosa, glucosa, cloruro cálcico, etc, a distintas dosis.

Agrobacterium and crown gall disease http://www.esf.edu/efb/course/EFB530/lectures/agrobact.htm

Agrobacterium causes Crown gall disease.
This disease occurs when the soil bacterium Agrobacterium tumefaciens enters a stem through a wound site (crown is the stem just above the soil surface).
This causes proliferation of tissue, like cancer growth (gall)
and can occur on many dicot species (grape, fruit and nut trees etc.).

Does this have to do with hormones?
One can heat a gall to 42C, kills Agrobacterium, but not plant cells, gall continues to grow and proliferate even in absence of bacteria.
The gall tissue cells can divide and grow on tissue culture medium without hormones (they have no requirement for auxin or cytokinin)
The gall tissue contains abnormally high amounts of auxin and cytokinin and have the machinery to synthesize those hormones
This machinery is gained by the stable transfer of genes from Agrobacterium to the infected plant cells.

Agrobacterium transfer DNA into the plant cells.
The DNA from the bacterium is integrated into a plant chromosome. The transferred DNA (T-DNA) is a portion of a large plasmid. In Agrobacterium tumefaciens, this is the Ti (tumor inducing) plasmid.

The T-DNA includes genes for enzymes involved in IAA (indole acetic acid), cytokinin, and opine biosynthesis. Two genes, iaaM and iaaH, encode enzymes for the production of IAA, one gene, iptZ, encodes an enzyme for the production of cytokinin. These genes are different from the plant genes for hormone synthesis enzymes These genes on the bacterial Ti plasmid have eucaryotic plant-type promoters
another gene encodes octopine synthetase, an enzyme for the production of the opine, octopine, a modified amino acid

The overproduction of hormones causes cell proliferation, while the opine produced serves as a source of nitrogen for the bacterium, but not for the plant.

Mutations in individual genes of the T-DNA can cause different types of tumors to grow.


Mutations in the iaa genes result in shooty tumors whereas mutations in the ipt gene causes rooty tumors.

Agrobacterium or the Ti plasmid and plant transformation

A recombinant plasmid:

The genes for hormone and opine synthesis are removed from the Ti plasmid and are replaced with a selectable marker, a gene which allows for growth of only transformed cells, usually a drug- or herbicide-resistance gene (e.g, kanamycin resistance). One can also add in another gene, from any source, as long as it has a plant promoter (such as herbicide resistance, insecticidal proteins, vitamin synthesis, etc.)

in a bacteria:
Agrobacterium is transformed with this modified plasmid. Leaf disks are dip in a suspension of the Agrobacterium. The bacterium transfers the T-DNA with these genes into the plant cells and the genes become integrated into the plant chromosome

selection:
the leaf disks are placed on tissue culture medium with the drug, so only drug-resistant cells grow with the appropriate addition of hormones, leaf cells can grow and eventually develop into shoots and roots, regenerating a whole plant that is transgenic.

Biolistic transformation

Agrobacterium-mediated transformation is only effective among plants that the bacterium can infect This includes most dicots. Monocots (like maize, rice, and wheat) are not susceptible to Agrobacterium and have not been effectively transformed this way.

Instead, one may coat gold or tungsten particles with DNA, then "shoot" these into plant tissue. At a low frequency, this DNA is integrated into the plant chromosome, allowing for transformation of species that have not worked with Agrobacterium
Pictures:
http://anka.livstek.lth.se:2080/microscopy/Agrobact.htm


Question - What can you tell about the Ti Plasmid?
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This plasmid is named for a plasmid found in a bacteria called Agrobacter tumefaciens. It causes "plant cancer" or what are known as galls. They are little tumors in which the bacteria can grow and live in the plant. Ti stands for tumor inducing. The bacterium gets into the plant through some kind of wound, ie.
a scratch. It injects its plasmid into a plant cell and the plasmid inserts its DNA into the plant's DNA. Then the DNA directs the plant to make a hollow tumor where the bacteria can live. Scientists have taken advantage of this plant's ability to insert foreign DNA into another plant.

They take the genes out of the plasmid that cause galls and insert genes of interest, ie. genes for pest resistance and let the plasmid carry those genes into the plant. The plant will start making the product you want. You may have seen a picture of a tobacco plant glowing because firefly genes for glowing were inserted into the plant. They did this so they could know if the gene had made it into the plant. Once they are sure the gene they want has made it into the plant, they clone the plant cells. By the way, plant tissue culture is a procedure that is very common and has been done for years, this is not the same as cloning animals.

Van Hoeck


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Selección de transformantes

El rendimiento de la operación siempre es débil. Hay que escoger el pequeño número de plantas que expresan el transgén y eliminar todos los otros. Para la selección, lo más simple es utilizar un gen de resistencia a un antibiótico ó a un herbicida. Este gen es insertado en el plásmido. Si las células son cultivadas en un medio que contiene el antibiótico o el herbicida las células que incorporaron el plásmido serán las únicas que sobreviven.

Este método es muy controvertido, porque acaba en una diseminación de los genes de resistencia ya sea a los antibióticos, o ya sea a los herbicidas. La transmisión horizontal de los genes ha sido demostrada. La diseminación de los genes no puede ser controlada. Se tienen que reemplazar estos métodos.

Actualmente se incorporan al plásmido, genes que permiten la utilización de otras fuentes de carbono que las utilizadas por la célula. Sólo sobrevivirán en presencia de esta fuente, las células que contiene el plásmido que lleva el gen selectivo.

Es muy importante conocer el modo en el que las células han sido seleccionadas para decidir la aceptación de un transgène.





Ejemplos de plantas transgénicas

 

1. Resistencia a herbicidas

La resistencia a los herbicidas es conferida por genes de resistencia descubiertos en ciertas bacterias ó en ciertas plantas como las petunias. Ahora, tenemos soja, colza y algodón transgénicos.

La resistencia a los herbicidas simplifica el control de las malas hierbas en el momento de la cultura. Hasta el día cuando la resistencia será transmitida también a las malas hierbas.

2. Resistencia a plagas y enfermedades

El Bacilo thurigiensis exprime una proteína tóxica para muchos insectos, pero no para otros organismos. El gen que codifica esta proteína ha sido introducido en ciertas plantas. El fin es el de disminuir el consumo de insecticidas.

Se estudia la resistencia a los virus. Lo que permitiría proteger los cultivos de tabaco, de papas, de tomates, de calabacines, etc. Pero todo aquí está al punto de ensayos. Sería interesante medir el tiempo, ó cuánto hace falta hasta que los insectos y el virus se vuelvan resistentes a las técnicas utilizadas.

3. Mejora de las propiedades nutritivas y organolépticas

El conocimiento del metabolismo de las plantas permite mejorar y presentar mejoramientos de sus características. Por ejemplo en el tomate mejoramos la textura y la coherencia del fruto. También se controla el proceso de madurez.

4. Resistencia a estrés ambiental

La productividad de muchos cultivos es comprometida por la gran variedad de presiones ecológicas, como la sequedad, las heladas, etc. La resistencia en las condiciones desfavorables es controlada por varios genes. Es difícil de obtener ahora un medio transgénico de crearlas. Un ejemplo de mejoramiento de la resistencia de una planta a las heladas ha sido efectuado por medio de Pseudomonas syringae y Erwinia herbicola. El hábitat natural de estas bacterias son las plantas.

Estas bacterias son responsables de daños de geles sobre muchas verduras. Facilitan la producción de los cristales de hielo a partir de una proteína que actúa como núcleo de cristalización. La separación del gen que codifica esta proteína permite conseguir colonias de estas bacterias que, una vez inoculada en grandes cantidades en la planta le confieren una resistencia más grande sobre las temperaturas bajas.

5. Otras aplicaciones

En horticultura se han podido conseguir variedades de colores normalmente imposibles y que hubo que obtener por medio de cruzamientos ó de hibridizaciones. Se han obtenido así rosas azules (terribles) introduciendo un gen de petunia responsable de la síntesis del pigmento responsable del color azul (terrible).

También se ha producido un plástico biodegradable por medio de las plantas en las cuales se han insertado los genes que codifican el poli - b-hidroxibutirato.

Finalmente, también plantas transgénicas "posiblemente" serán desarrolladas para producir vacunas contra el tétanos, la malaria etc. (a partir de plantas como el plátano, la lechuga ó el mango).



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1. microorganismos transgénicos
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Universidad catholica de Louvain, Facultad de Medicina 

biologia molecular, Cochabamba, Bolivia, abril 2006
Plantas transgénicas
Jean-Pierre HERVEG* y Maritza BARCIA-MACAY**
*Université de Louvain, Unité GECE, Christian de DUVE Intitute of cellular Pathology (ICP), Brussels, Belgium.