plan:

1. Cuestiones para el examen.
2. Los cebadores.
..........a. un ejemplo para introducir el sujeto.
..........b. las calidades de cebadores buenos
..........c. bancos de datos y programas.
..........d. cebadores ordinarios.
..........e. cebadores con sitio de restricción
.................adición de sitio
................modificación de los cebadores-->.......................
..........f. cebadores para iPCR y mutagenesis
..........h. ejemplos y ejercicios (amarillos)
3. sínthesis de oligonucleótidos
4. La temperatura de hibridación y la concentración en Mg++.
5. la concentración de los cebadores

Plan:

1. Questions for the examination.
2. Primers.
..........a. an example to introduce the subject.
..........b. the qualities of good primers
......... c. databanks and programs.
..........d. ordinary primers.
..........e. pimers to detect methylation.
..........f. primers with restriction sites.
.................site additionprimer mutationse
.................primer modification
..........g. primers for iPCR and mutagenesis.
..........h. examples and exercises (yellow, in spanish only).
3. synthesis of primers (in spanish only).
4. Annealing temperature (in spanish only).
5. primer concentration (in spanish only).

1. Cuestiones para el examen:

¡ Para el examen, usted debe poder buscar primers y verificar sus calidades!
Ejercítese con los programas para "Window".
En el texto, los sitios internet donde estos programas existen son indicados.

1. definir "cebador".
2. Explicar la palabra annealing.
3. ¿ Cual es la extremidad del cébador que es alargada por la DNA pol? Cual nucléotidos debemos encontrar en esta extremidad
4. ¿ Qué es una PCR "in silico"?
5. ¿ La temperatura de hibridación de los cebadores depende de la concentración en sal?
6. ¿ Cuáles son las calidades que deben poseer los cebadores?
7 ¿ Cómo calcular la temperatura de "annealing"?
8. ¿ Cómo se sintetizan los cebadores?
9. ¿ Cómo se diluyen los cebadores?
10. ¿ A que velocidad trabaja laTaq ADN pol?
11. ¿ Cómo escoger y analizar un par de cebadores que puedan detectar KERP1.
12. Definir "hot start" y describir un método simple para realizarlo.

1. Questions for the examination:

You should be able to find a pair of primers and verify their fitness.
You should exercise yourselves with the programms.
The internet adress of the programms is indicated in the text.

1. What's a primer ?
2. What does "annealing" mean ?
3. At what end of the primer does the DNA pol add nucleotides?
What should be the last nucleotide at the 3' end of any primer.
4. What is "PCR in silico" ?
5. Does the annealing temperature of the primers depend on salt concentration ?
6. What are the qualities of a good primer ?
7. How do you compute the annealing temperature of a primer ?
8. How are the primers synthetized ?
9. When you get your primer, how do you dilute them.
10. What is the speed of the Taq DNA pol ?
11. How to choose and analyze a pair of primer to detect KERP I.
12. What's a hot start and how do you make one ?

a. ejemplo

3' agttcgtacgctagttcagctcgatcaggcgtaatggccgtttagct 5'
Esto es una plantilla
Esta plantilla es orientada 3 ' -> 5 '

5' tcaagcatgcgatcaagtcg 3'
esto es un cebador (un oligonucleótido)
Está constituido por 20 nt
posee un "c" tiene su extremidad 3'
posee 10 "a +t" et 10 "g + c"

5' tcaagcatgc gatcaagtcg 3'
Tiene una constitución homogénea, es decir 5 "a" o "t" sobre la mitad de la izquierda y la misma cosa sobre la mitad de la derecha.

a. example

3' agttcgtacgctagttcagctcgatcaggcgtaatggccgtttagct 5'
This is a template.
This template is oriented 3' --> 5'.

5' tcaagcatgcgatcaagtcg 3'
This is a primer (an oligonucleótido)
It is constituted by 20 nt
It has one "c" its 3 ' end.
It has 10 " to +t " et 10 " g + c "

5' tcaagcatgc gatcaagtcg 3'
It has a homogeneous constitution, that is to say five "a" or "t" on the half 5' end and the same number on the 3' half end ..

b. las calidades de cebadores

Para hacer una PCR hace falta un par de cebadores.

Cada cebador del par debe poseer las calidades siguientes:
1. Debe contener por lo menos 17 nt.
2. Tener una G o una C en la extremidad 3 '.
3. Tener una temperatura de fusión superior a 55 ° C.
4. Tener una constitución homogénea: debe tener allí tanto de A o T en cada mitad.
5. No debe formar homodimeros (Utilizar un programa para verificar).
6. No debe formar parte de una secuencia repetitiva del organismo para el cual está previsto (Verificar en los bancos de datos con los programas ad hoc, BLAST...)

Los dos primers de un par deben poseer las calidades siguientes:
1. No deben formar pe dimères entre ellos.
2. Su temperatura de fusión debe ser más idéntica posible.

b. the qualities of good primers

To make a PCR, We need a pair of primers.

Each primer from the pair needs the following qualities:
1. contains at least 17 nt.
2. Have a G or a C at the 3' end.
3. Have a Tm higher than 55° C/
4. Be homogeneous , i.e. have the same number of A and T in each moeities.
5. They should not form homodimers (you should use a software to verify).
6. they should not be part of a repetitive sequence of the organism (verify on the databanks, using programms like BLASTS).

Both primers of one pairs need the following qualities/
1. not form heterodimers
2. Thei Tm should be very close

c. bancos de datos y programas.
(c. databanks and programs, Todo está en inglés.)

Los programas gratuitos (en inglés):


1. http://jullien.n.free.fr/article.php3?id_article=10
AmplifX (English page). Test, manage and design your primers for PCR.
The main purpose of AmplifX is to seek in a collection of primers, such as any molecular biologist get in his refrigerators, those which can be use to amplify a fragment into a target sequence (este programa existe en inglés y en francés.)
- Mac OS X (For Mac OS X)
- Windows (For Windows, tested with Windows 2000, XP and 98)

2. http://engels.genetics.wisc.edu/amplify/
Amplify is a freeware Macintosh program for simulating and testing polymerase chain reactions (PCRs). It can also be used as a tool for designing primers by evaluating candidates.

3. http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

Los bancos de datos (en inglés):


http://www.tigr.org/
The Institute for Genomic Research (TIGR) is a not-for-profit center dedicated to deciphering and analyzing genomes

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
NCBI is the national center for molecular biology information. It creates databases, conducts research, develops software tools for analyzing genome data, and disseminates biomedical information.

BLAST (en inglés):
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
The Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) finds regions of local similarity between sequences. The program compares nucleotide or protein sequences to sequence databases and calculates the statistical significance of matches. BLAST can be used to infer functional and evolutionary relationships between sequences as well as help identify members of gene families.

d. cebadores ordinarios.

d. ordinary primers.

Le choix des primers dépend de plusieurs choses
..........Le but de la PCR ou de la RT-PCR: détecter un gène ou une mutation:
L'amplicon qui doit servir à vérifier la présence d'un gène peut avoir n'importe quelle taille. Pour la RT-PCR, il faut toujours un contrôle sans RT-DNA pol. Pour vérifier les épissages alternatifs, il faut bine entendu que la région alternative soit amplifiée. Si l'amplicon sert à détecter une mutation, les primers doivent être situés de part et d'autre de celle-ci.
..........La taille de l'amplicon:
La taille de l'amplicon détermine la position des primers et la longueur du temps d'extension durant la PCR.
Où doivent se situer les primers:
Si les primers doivent servir à la RT-PCR, il ne faut pas oublier.

Utilisation des soft:
..........L'utilisation des soft n'est pas indispensable pour chercher des primers. Par contre, les softs sont la meillerure façon de les évaluer.
.........

e. primers to detect methylation:

f. cebadores con sitio de restricción.

A veces es necesario construir un par de cebadores, cada cebador con un sitio de retriction. Después PCR, el amplicon exponencial contiene un sitio de restricción a ambos finales. Este amplicon entonces puede ser insertado dentro de un plasmid y reproducido en E. coli. Nosotros deberíamos usar un sitio de restricion diferente para el sentido y el antisentido cebador para conseguir un encarte orientado. Deja añaden un sitio Eco RI (gaattc/cttaag) al final izquierdo y un sitio de Bgl II (agatct/tctaga) en el derecho.

Hay varios modos de solucionar este problema:

f. primers with restriction sites.

If we want to clone the amplicon through an unexpensive plasmid, it is necessary to construct a pair of primers, each containing a retriction site. These sites should be present on the plasmid too. After PCR, the exponential amplicon contains a restriction site at both ends. This amplicon can then be inserted inside a plasmid and cloned through E. coli. We should use a different restricion site for the sense and antisense primers to get an oriented insert. Lets add a Eco RI site (gaattc/cttaag) at the left end and a Bam HI site (ggatcc/cctagg) at the right one.

There are several ways to solve this problem:

A. First method: site addition

1. we should add the first semi Eco RI site " 5' gaattc 3' " to the sense primer. Let's suppose that we want to add to the sense primer the sequence GAATTC which will create the site GAATTC/CTTAAG for the enzyme Eco RI.
let the primer be:
............................5' ggaaagacgatcagataccgtc 3'
we will create this primer:
............................5' gaattcggaaagacgatcagataccgtc 3'
But, we add a G and a C at the 5' end because it was shown that this increases (90% after 2 hours) the ability of the enzyme to cut the site:
............................5' GgaattcCggaaagacgatcagataccgtc 3'

2. we should add the second semi Bam HI site " 5' ggatcc 3' " to the antisense primer.
............................5' catccttctactgttcggtc 3'
we will create this primer:
............................5' ggatcccatccttctactgttcggtc 3'
But, we add a 2 CG at the 5' end because it was shown that this increases (90% after 2 hours) the ability of the enzyme to cut the site:
............................5' CGggattccCGatccttctactgttcggtc 3'

To get a better answer, we should construct a longer primer, so that the addition will not affect the PCR. One have also to try several temperatures.

modified restriction sites to be added (in black) to the primers (in red) to get 90 % hydrolysis after 2 hours:

Afl III...........CCacatgtGG
Asc I.............ggcgcgcc... (no addition necessary)
 .............;;;;AggcgcgccT
Ava I.............CCcccgggGG
Bam HI............CGggatccCG

Cla I.............CCatcgatGG
Eco RI............GgaattcC
Hae III...........GGggccCC ..(lack of specificity)
..................AGCggccGCT
Hind III..........CaagcttG
Kpn I.............GggtaccC
Mlu I.............GacgcgtC

(from New England Biolab, 1993-1994 catalog)

B. Second method: primer modification

1. transform slighly the first primer to create the site Eco RI
" 5' gaattc 3' "
-->.......................5' ggaaagacgatcagataccgtc 3'
-->.......................5' ggaaagacgatcagaattcgtc 3'
1. transform slighly the second primer to create the site Bgl II:
tctaga
-->.......................5' catccttctactgttcggtc 3'
-->.......................5' catccttctagagttcggtc 3'
As the annealing is not perfect(3/20 and 2/20), the annealing temperature of the first cycles of the PCR should be made at a lower temperature.
What does lowering the temperature means. Generally, it is agreed that temperature should decrease of one degre by 10 % mismatch. Then, 3 nt out of 20 makes, a 15 % mismatch decrease the température by 1.5° C. However, the annealing tempreature stay experimental.

g. cebadores para iPCR y mutagenesis.

g. primers for iPCR and mutagenesis.

h. ejemplos y ejercicios.

el amplicón.

Esto es una secuencia que deseamos ampliar.
La colocamos en nuestro programa (Amplify 3X). Dónde esta llamada la "Test Target Sequence".
El fragmento ampliado entre las extremidades 5 ' de los cebadores es llamado "un amplicón".
Los cebadores son indicados en azul.
En verde, reconocemos una sitio de la enzima de restricción Bgl I.

los cebadores:

5' ggaaagacgat cagataccgtc 3'
El primero cebador se acaba por C en 3 '. Las dos mitades contienen el mismo número de A o T. el cebador es homogéneo.
5' catccttcta ctgttcggtc 3'
El primero cebador se acaba por C en 3 '. Una de las mitades contiene 6 A o T, el otro 4. El cebador es es no homogéneo.

PCR "in silico"

Esto es la PCR in silico. Vemos que el amplicone es 289 bp. In silico significa teórico. El programa efectúa el PCR

Dimeros:

Tenemos aquí un ejemplo de dimero obtenido a partir del primero premiar(sobresalir,superar).

Ejercicio:
buscar dos cebadores para el gen de la beta-globina, que dará un amplicon de de 300 a 500 bp alrededor de la mutación que produce la cycle cell anemy.

3. La síntesis de los oligonucleótidos

 

Máquinas robóticas son capáces de sintetizar fácilmente oligonucleótidos con más de 40 bases de talla. El único factor limitante es que el rendimiento disminuye cuando la talla del oligo aumenta. Debemos también purificar los oligos después de sus síntesis. La síntesis de los oligonucleótidos se realiza usando un soporte sólido inerte, bolas de vidrio.

Se comienza por fijar el nucleótido (con una base n) en el 3' de la secuencia a sintetizar usando bolas de vidrio microscópicas. Este será el primer nucleótido de la secuencia. Estas bolas se introducen en tubos capilares donde se desarrolla la reacción.
(Ver el esquema de derecha.)

El segundo nucleótido [x - 1] es añadido a la mezcla para comenzar el primer ciclo. En 3 ', este nucleótido posee un grupo O-P, del que el fosfato es protegido por dos radicales. El grupo 5'-OH del premier nucleótido [x] reacciona con el fosfato substituido del segundo [x - 1]. El fosfito trivalente que se produce es oxidado en fosfato más estable que unirá los dos nucleótidos.

Al final, el grupo dimetoxiritilo (DMT) que protégé al hidroxilo 5' del segundo nucleótido (x - 1) es eliminado. Es al fin del primer ciclo que el [x - 2] nucleótido se añade.

El proceso se repite continuamente añadiendo el precursor del nucleótido siguiente cada vez. Al fin de la síntesis, los oligonucleótidos son separados del soporte y los grupos protectores del fosfato y de las bases son eliminados.

Los oligonucleótidos de síntesis tiene siempre una extremidad 5'-OH y no una extremidad 5 ' - P. Si se desea una extremidad 5' fosfato, sólo hace falta ordernarlo en la planilla de compra.

Los nucleótidos comerciales generalmente son surtidos en pequeños tubos cilíndricos. Son o de polvo liofilizado o en solución. La cantidad surtida es, la mayoría de las veces, de ± 100 nanomoles. Los oligos liofilizados pueden ser conservados a temperatura ambiente. La solución es mM. El precio de un oligonucleótido está alrededor de $ 1.O por nucleótido.

 

4. La temperatura de hibridación:

La temperatura de hibridación elejida para la PCR es genralmente igual ó superior en 2 à 3°C a la temperatura de fusión del oligonucleótido ( Tm ó melting temperature). Una manera calcular ésta temperatura es la siguiente:

Tm = 2°C x (número de bases A, T) + 4°C x (número de bases G, C)

Esta fórmula se usa para oligonucleótidos largos entre 11 a 20 nucleótidos y entre 1 M NaCl
ex. : oligo CTC.AGA.ACC.ACC.GAG.CCC
Tm = 4°C x 12 G,C + 2°C x 6 A,T = 48 + 12 = 60°C

Para oligonucleótidos más largos que 20 bases, se puede utilizar la fórmula siguiente:
Tm = 16,6 log10(M) + 0,41 (Pgc) + 81,5 - Pm -B/L -0,65 (Pf)

M es la concentración molar de NaCl, no pasa de 0,5 M
Pgc es el porcentaje de G y C en el oligonucleótido (genralmente entre 30 y 70 %)
Pm es el porcentaje de bases no aparejadas (cada porcentaje de no-aparejo hace disminuir la Tm a 1°C);
Pf es el porcentaje de formamida en el medio.
B tiene un valor de 675 (para sondas hasta 100 bases).
L es la longitud de la sonda en bases.

---------------------------------
Tm (melting temperature): temperatura de fusión

Se puede también simplemente utilizar la tabla que se presenta a continuación. Para calcular la Tm de dos oligonucleótidos se utiliza la temperatura del primero a la cuál se le aumenta 5°C. Al elegir un oligonucleótido se recomienda elejir aquél que contenga el número mayor de G-C.

La temperatura de annealing de los cebadores es un dato experimental.

En práctica, utilizo el ábaco para determinar la primera temperatura. Busco para cada uno de los dos primers la temperatura ideal. Luego escojo el température de más bajo + cinco grados.

Hago primero un PCR a esta temperatura, a x ° C. Hago el PCR siguiente a x + 3 °, x + 6 ° y x + 9 °. Hago un électrophorèse con los productos de las cuatro reacciones y escojo como temperatura de reacción la que da la banda más importante.

5. la concentración de los cebadores

En los países calientes, como Bolivia, hay que mandar el cebadores bajo forma liofilizada. Sobre la etiqueta, la secuencia del cebador es a menudo indicada, así como su dirección: sentido o antisentido.

Hay que buscar el número de nanomoles que contiene el polvo. A cada pequeño tubo, añadimos un número de microlitro de agua (sin DNasa) igual en total de nanomoles. Realizamos de ese modo una solución mM.

Preparamos luego dos nuevos tubos. Les añadimos 1 microlitro de solución mM y 99 microlitros de agua (sin DNasa). Las soluciones son ahora 10 micromolares.

Solución mM luego están colocados a -20 °. Anotamos el lugar donde están. ¡ Jamás olvidemos poner etiquetas sobre los tubos de cbadores!

En el PCR, los cebadores son micromolar.