biologia molecular
8. Expressión de genes clonados en E. coli
Jean-Pierre HERVEG y Maritza BARCIA-MACAY
Cochabamba, Bolivia, abril 2006


plan


A. la transcripción en las bacterias

a. introducción: La transcripción en general
b. Control de la transcripcion: el
opéron lactose
c.
comienzo de la transcripción
.....ARN polimerasa (ARN pol):
.....la sub-unidad sigma:
.....promotor
c.
terminar la transcripción
.....terminadores (t)

B. la traducción en los procariotas
.........secuencia Shine-Dalgarno (SD)

C. Expresión de genes de mamíferos en bacteria
.....a. proteínas de fusión
.....b. proteínas no fusionadas
.....c. cuerpos de inclusión

D. Ejemplos
.....a. La insulina
.....b. La hormona del crecimiento humano (hGH)


a continuación

Cuestiones para el examen

1. Definir la transcripción.
2. ¿ Cuál es el azúcar y la basa específicos del ARN?
3. ¿ Con cuál base se aparea el uralcilo?
4. ¿ Que abastece la hidrólisis del PPi?
5. ¿ A qué sirve un promotor?
6. Definir la palabra opéron.
7. ¿ Cual diferencia hay entre operon y policistron?
8. ¿ Que es que X-gal?
9. ¿ Que es que lacZ?
10.¿ Que es que IPTG?
11. Définir: operon y repressor.
12. describir el opéron lactose.

13. ¿ Cuál es la proteína codificada por el gen i en casa de E coli?
14. ¿ Cómo la ARN pol de E. coli hace para fijarse sobre su promotor?
15. ¿ Que es que la caja de Pribnow?
16.¿ Que es que un terminador?
17. ¿ Cómo se acaba la transcripción?
18. ¿ Que es que la secuencia de Shine-Delgarno?
19. ¿ Queremos exprimir un gen de mamífero en E. coli, cuáles son los problemas puestos?
20. ¿ Que es que una proteína de fusión?
21. ¿ Podemos producir proteínas nativas en casa de E. coli?
22. ¿ Lo que es lo que una etiqueta histidina?
23. Describa la síntesis de la insulina por E. coli.

a continuación


A. la transcripción en las bacterias

a. introducción: La transcripción en general

La transcripción es el proceso por el que se transmite la información contenida en el ADN al ARN. La ARN polimerasa utiliza como molde una de las dos cadenas del ADN, la cadena codificante. Al principio de la transcripción se reconoce un sitio específico de la molécula de ADN en el que se van a unir las proteínas del complejo de ARN polimerasa. Este sitio específico se denomina promotor del gen.

1. Los actores de la transcripción

El ARN:

Como el ADN, el ARN es una molécula de ácido nucleico. El ARN casi siempre está formado por una única cadena. El azúcar del ARN es la ribosa. El ARN tiene los nucleótidos G, A y C, pero la timina (T) se sutituye por el uracilo (U).

El ARN puede sirve como una suerte de mensajero genético, transmitiendo la información guardada en el ADN de la célula, desde el núcleo (En las células que tienen un núcleo) hacia otras partes de la célula donde se usa para ayudar a producir proteínas.

El ARN se transcribe a partir de una de las dos cadenas del ADN.

Vemos aquí sólo lo que es neceser para nuestro curso. Para de más amplios información el estudiante debe ir a el sitio:
http://www.um.es/~molecula/anucl03.htm

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chain: cadenas
template: molde
sugar: azúcar


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La ribosa
Es un azúcar de 5 carbonos. Es un componente estructural de la estructura del ARN, como el ATP, GTP, CTP y TTP. Forma parte de la estructura de los nucleótidos que forman el ARN.

El uracilo
Es una de las 4 bases del ARN. Se representa con la letra U. En el ARN, El uracilo reemplaza a la timina. El uracilo se aparea con la adenina. El porqué el ARN contiene uracilo en vez de timina No es conocido.


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ARN polimerasa y rNTPs

Enzima encargada de la síntesis de ARN a partir de molde de ADN.
La reacción que cataliza consiste en:

(ARN)n-residuos + NTP <===> (ARN)n-residuos + 1 + PPi.

NTP: nucleósido trifosfato (ATP, CTP, GTP y UTP); posteriormente, el PPi se hidroliza, lo que abastece la energía de la reacción.
Todas las células contienen una o varias ARN polimerasas.
En procariotes esta una enzima. Esta enzima sintetiza todo los ARNs excepto el necesario para el cebador en la replicación del ADN (esta reacción es catalizada por la primasa).
Algunos bacteriofagos sintetizan una ARN polimerasa que solo sintetiza ARN específico del fago. En eucariontes hay 4 ó 5 ARN polimerasas diferentes que sintetizan diferentes tipo de ARNs.

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primer: cebador.

promotor
La polimerasa se une a una secuencia llamada promotor que normalmente está delante de la secuencia que especifica el RNA. El primer nucleótido que está en el RNA (incluyendo en el promotor) es el +1 y todas las bases se toman desde ese punto de referencia, delante - y detrás +. El resto del promotor no se transcribe.

ribonucleótidos
Los nucleótidos, ribonucleótidos y desoxiribonucleótidos están compuestos de una base nitrogenada, un azúcar (ribosa o desoxiribosa), y un grupo fosfato. Si el azúcar es ribosa se trata de ribonucleótidos, constituyente del ARN.

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b. Control de la tanscripción:
el opéron lactosa:

Se denomina operón lactosa a una sucesión de gens adyacentes, transcritos en un sólo ARNm. El operón contiene también la región de regulación.

Los operones se encuentran en los eucariotas (Trypanosmas spp.) y en ciertos procariotas. En la figura de la derecha, se ha esquematizado el operón lactosa, comenzando por el gene [i], entonces el operador [Op]. El contiene regiones que codifican la ß-galactosidasa [Z], la permeasa [Y] y una transacetilasa [A].

el gen [i]:
El gen i codifica el répresseur. En la ausencia de lactosa, el represor es codificado por un gen [i]. el represor se fija en el operador [Op] y la transcripción del operón se inhibe.

ß-galactosidasa y X-Gal:
E. coli utilisa los productos de la hidrólisis de la lactosa: la glucosa y la galactosa. La ß-galactosidasa hydrolisa la lactosa. Si no encuentra lactosa en el medio de cultivo, E. coli exprime solamente muy poco de ß-galactosidasa. Al contrario, en presencia de lactosa, la ß-galactosidasa es abundantemente expresada. La ß-galactosidasa hidrolisa también el substrato sintético X-gal: ella produce entonces un compuesto coloreado en azúl.

LacZ alfa peptido (lacZ):
El LacZ-alfa péptido es una parte de la ß-galactosidasa que no posee actividad por sí misma, pero que es necesaria para la acción de la enzima. LacZ forma parte del gen de ß-gal. Es posible cortar la secuencia LacZ y meterla en un plasmido donde ella exprimirá el péptido alfa. Existen cultivos comerciales de E.coli a los cuales se les ha quitado el alfa péptido y de plásmidos que continen ése péptido. Para poseer actividad ß-gal, ésas bactérias deben haber sido transfectadas con un plásmido codante de LacZ.

inductor (la lactosa y el IPT):
La lactosa cuando está presente es un inductor de la expresión de ß-gal. Existen otros compuestos capáces de reaccionar é inducir. En el laboratorio, se utiliza como inductor el isopropil -b-D-galactosido (IPTG). En efecto, al contrario de la lactosa, el IPTG no es metabolizado y subsiste en el medio.

 

El operador:
Es una secuencia en el operón en la que se fija el represor.
La disposición espacial unducida por la fijación de ése represor en el operador impide que la ARN polimerasa se fije en el ADN para comenzar la síntesis de l'ARNm codificante de la ß-galactosidasa.


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a. comienzo de la transcripción


ARN polimerasa (ARN pol):

En las bacterias sólo existe una ARN polimerasa (ARN pol). Las ARN pols de las bacterias se unen directamente al ADN sin utilizar un complejo de iniciación. La ARN pol de la bacteria E. coli está constituido por una enzima de base tetramérica que contiene sub-unidades de tipo alpha y ß con una esteroquiometría alpha2ßß'. El asemblaje alpha2ßß' es suficiente para alargar la transcripción.

la sub-unidad sigma:
La iniciación por otro lado necesita la sub-unidad sigma, que completa a ésta holoenzima (alpha2ßß'sigma). El factor sigma reconoce al promotor. La enzima de base se puede unir al promotor en ausencia de sigma, pero solamente de manera inéficaz y sin especificidad. La función principal del factor sigma es la de aumentar la eficiencia de la unión de la ARN polimerasa al promotor y de reducir los enlaces inespecíficos. Un solo factor s (s70 chez E. coli) comienza la transcripción de la mayoría de gens. Ciertos bacteriófagos (virus de bacteria) como el T4, sintetizan su propio factor s que tiene la habilidad de cambiar la enzima de base de su víctima E. coli para que ella sólo y únicamente transcriba los gens del fago.

promotor:
La ARN polimerasa explora la doble hélice del ADN de la bacteria y se lía de manera débil a ella hasta que encuentra a un promotor. La enzima se une entonces fuertemente a la secuencia del promotor, desnatura un segmento pequeño de ADN cercano del promotor y comienza la transcripción de éste ADN en ARN. El factor sigma se disocia de la holoenzima cuando alrededor de una docena de ribonucleótidos han sido asemblados. El primer nucleótidodo de la cadena de ADN contiene genralmente una purina (adenina ó guanina). Los promotores bacterianos poseen cuatro características comunes: (1) lel punto de comienzo de la transcripción, denominado +1, (2) la secuencia de la posición ­10 llamada caja de Pribnow (TATAAT), (3) la secuencia ­35 (TGTTGACA) y (4) la distancia entre las secuencias ­10 y ­35. E punto donde se inicia la transcripción es genralmente una purina (A ou G).

 

La distancia entre los 2 sitios representa un solo giro de la hélice, lo que permite a los 2 motivos de reaccionar al mismo tiempo con el factor sigma.



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b. terminar la transcripción



terminadores (t):
En las bacterias y las levaduras, la transcripción se termina en secuencias discretas llamadas terminadores (t) gracias a dos mecanismos que responden más a una señal de transcripción del mismo que a una señal del gen.

terminación r -independiente:
El mecanismo más común es el fin intrínsico ó terminación r -independiente. Los transcriptos adoptan estructuras secundarias que obligan a la ARN polimerasa a frenar. Un motivo o secuencia de terminación frequente es una secuencia repetida, inversada y rica en G, C seguida por una secuencia poly-U.


El palíndrome rico en G, C forma una especie de bincha ú horquilla, que obliga a la ARN polimerasa a hacer una pausa. En ése momento las 2 hebras de ADN se encuentran y pueden aparejarse. La ARN polimerasa se dissocia entonces de la matríz y una de las hebras del ARN formado se libera.

La efficiencia de la terminación en sitios r-independient es varía entre menos de 25 % a más de 75 %.

terminaison r-dépendante:
El otro mecanismo de finalización (terminaison r-dépendante), llamado dependiente, es poco utilizado por los gens del cromosoma bacteriano, pero frequentemente utilizado por fagos, como el fago lambda. Este utiliza una proteína que se llama r (rho) que tiene la capacidad de poder unirse a un sitio específico del transcripto. Este sitio a menudo contiene una secuencia rica en citidina, pobre en guanosina y tiene una longitud de 50 a 100 nucleótidos. La proteína r separa el ARN transcripto a partir de un ADN matríz producto de una reacción directa con la ARN polimerasa.


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B. la traducción en las bacterias

 

secuencia Shine-Dalgarno (SD):
El sitio de fijación del ribosoma utiliza el codón de iniciación de la traducción (AUG) y una secuencia de 3 a 9 nucleótidos situadas entre el 3 y 11 nucleótido encima del codón de iniciación. Esta secuencia se denomina Shine-Dalgarno (SD) y es complementaria a la extremidad 3' del ARN 16S de la E. coli. La secuencia consensus es UAAGGAGG. El enlace del ribosoma al ARN es facilitado par el cruze entre la secuencia SD del ARNm y la secuencia de la extremidad 3' del ARN 16S

 


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C. Expresión de genes de mamíferos en la bacteria E. coli

 

Las células bacterianas son extremadamente útiles para la traducción activa de proteínas de mamíferos, immunológicamente activas.

proteínas de fusión
proteinas compuestas, formadas de una porción amino-terminal como la de la beta-galactosidasa (LacZ) fusionada en proteínas eucariotas son utilizadas para preparar anticuerpos policlonales ó monoclonales. Estos anticuerpos se pueden usar para purificar proteínas por cromatografía de afinidad, para diagnosticar y cuantificar niveles de proteínes, para localizar proteínas en organismos, en tejidos y en células individuales y en combinación con otras técnicas como la immunofluorescencia.


proteínas intactas nativas
Otras proteínas intactas nativas han sido ya producidas en grandes cantidades en la E. coli para realizar estudios funcionales. En otros casos, una gran cantidad de proteínas eucariotas han sido sintetizadas a partir de bacterias pero con replicación de manera incorrecta ó poco eficáz y con poca actividad biológica.

Otro problema es que las proteinas producidas por éstos métodos pueden presentar modificaciones post-tranduccionales como la formación incorrecta de enlaces disulfuros, glucosilación, fosforilación, oligomerización ó proteólisis. Modificaciones que no han sido efectuadas por las células bacterianas. Este problema es particularmente agudo cuando se busca la expresión de receptores de superficie, hormonas extracelulares y ciertas enzimas.

La expresión de gen de mamíferos en la E. coli necesita también resolver los problemas siguientes:

1. los promotores eucariotas no son reconocidos por las ARN polimerasas bacterianas.

2. los gens eucariotas contienen intrones.

3. los ARNm eucariotas no son todo el tiempo traducidos por los ribosomas bacterianos ;

4. las protéinas presentes en grandes cantidades en las bacterias forman cuerpos de inclusión insolubles

5. las proteínas eucariotas pueden ser reconocidas como cuerpos extraños (foreign bodies) por las proteasas de la bacteria y ser degradadas.


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a. proteínas de fusión


1. vector pUR278:

Para clonar un gen se utilizan plásmidos disponibles en el mercado para ser usados en biología molecular. Así como hay muchos de plásmidos comerciales, escogeramos uno: el plásmido pUR278. Insertamos el gen de la proteína en la sitio de clonaje. La proteína de fusión será precedida de la la ß-galactosidasa (lacZ). El plásmido así transformado se introduce en una bacteria a la que se le ha suprimido el gen lacZ.

Clonar un gen de interés en 3' (= arriba) en un gen de E.coli con lacZ, ofrece tres ventajas:

1. la proteína de fusión se puede producir en grandes cantidades puesto que los sitios de iniciación de la transcripción y de la traducción son secuencias normales de la E. coli.

2. las proteínas de fusión son más estables que las proteínas extrañas nativas.

3. las proteínas de fusión son más grADNes que la mayoría de las proteínas de la E. coli y fáciles de identificar en un gel de poliacrilamida. La porción del gel que contiene la proteína puede recuperarse y ser utilizada para immunizar animales por ejemplo.


No hay que modificar la rejilla de lectura. El último codon del primer gen debe ser seguido por el primer codon del segundo. Hacen falta varios vectores para realizar esta continuidad. En efecto, cada vector posee sitios de restricion colocados para resolver este problema.

Los vectores disponibles como el plásmido pUR278, poseén una serie de sitios de restricción que permiten la introducción de un fragmento de ADN entre las tres entradas posibles en la parte 3' del gen lacZ. En ciertos casos, la construcción del gen de fusión necesitará ya sea rellenar ó eliminar un extremo adhesivo.


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2. vector pMAL:

maltose binding protéin (MBP)
La maltose binding protéin (MBP) es una proteína periplásmica. El gen de interes puede también ser clonado en el vector pMAL a lo largo del gen malE de la E. coli que codifica la proteína de ligado a la maltosa (maltose binding protein, MBP). La MBP es una proteína periplásmica que participa al transporte de maltosa en la bacteria. Gracias al promotor tac y a otras señales de iniciación de la traducción de la MBP, puede exprimir grandes cantidades de proteína de fusión.

el promotor tac and IPTG:
El promotor tac es un promotor híbrido trp-lac que puede ser reprimido por el represor lac, ó inducido por el inductor IPTG. El gen lacI que codifica el represor está presente en el plásmido.

complementación alpha:
La horquilla ó polylinker utilizada para la inserción de éste ADN extranjero está situada en la parte amino-terminal del fragmento de beta-galactosidasa (No representado en el esquema de derecha) permitiendo la complementación alpha, lo que le dona una coloracion « blanco/azúl » a las colonias bacterianas obtenidas.

purificaciôn de la proteina:
La proteína de fusión producida por plásmido recombinante se purifica en diferentes etapas, desde cromatografía de afinidad usando la finidad de la MBP por la amilosa. Luego se la libera de la columna mediante la utilización de una solución de maltosa. En la mayoría de casos, la proteína de fusión es soluble. Los rendimientos de obtención son del órden de 100 mg/L. Así mismo, el vector pMAL es ideado para que la proteína de fusión obtenida presente una secuencia de reconocimiento por una proteasa específica, (Facteur Xa, entérokinase ou thrombine) lo que permite de separar la proteína de interés de la MBP.



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b. proteínas no fusionadas

vector pET-3a (Stratagen).

 

Las proteínas no fusionadas pueden también ser producidas en las bacterias. Se procede insertando el ADNc de interés en el vector a lo largo de un promotor fuerte e inducible y también de una señal clara que permita una traducción efficiente de la proteína en question por los ribososmas de E. coli. Los niveles de expresión varían entre 1 y 30 % de proteínas totales de la bacteria. En la mayoría de los casos, ésto significa un enriquecimiento de al menos 1.000 veces en relación a la producción natural de la proteína. El véctor pET-3a es uno de los vectores.

Para producir una de ésas proteínas, es necesario entonces conocer su ADNc, el vecteur pET-3a, la bacteria huésped modificada y eventualmente el plásmido hôte pLys.

El vector pET-3a (promoter T7).
El vector de expresión pET-3a contiene un promotor fuerte, el promotor del bacteriófago T7 (P T7). Este promotor es específico de la T7 ARN pol, no deja acceso del ARN pol de la E. coli al gen clonado. La T7 ARN pol usa el gen de T7 que ha sido insertado en el cromosoma de la bacteria huésped.
Si la expresión del ADNc clonado es tóxico para la bacteria, los niveles de expresión de la T7 ARN polimerasa son mantenidos muy bajos cuando las bacteria se multiplican. Justo antes de cosechar las bacterias se induce la expresión masiva de la T7 ARN pol.

La bacteria huésped (T7 ARN pol gene, IPTG controlado).
Se utiliza una bacteria lisógena BL21 (DE3), en cuyo cromosoma se ha insertado el gen que codifica la T7 ARN pol precedido del promotor lacUV5. La expresión del gen de T7 ARN pol se controla mediante el promotor LacUV5. Este es un promotor del operón lactosa é inducible por la IPTG. Sólo muy débiles niveles de expresion de T7 RNA pol se producen cuADNo éste no es inducido.

El plásmido pLys.
Para controlar más estrictamente el nivel de la T7 ARN pol en la bacteria, se utiliza bacterias que contienen el plásmido pLys. Estos plásmidos codifican la lisoenzima de T7 que es un inhibidor de la T7 RNA polimerasa. Ellas reducen la capacidad de ésta polimerasa de transcribir ADNc cuando el promotor lacUV5 no está inducido.

El clonaje..
Los gens de interés se clonan en el plásmido sea en el sitio Ndel ó en el sitio BamHI.


Si el ADNc se clona en el sitio NdeI, la proteína expresada no será una proteína de fusión. Se puede observar en el esquema que NdeI proveé el codón ATG del gen a clonar.
Si al contrario, si la proteína se clona al nivel de BamHI, ella será una proteína de fusión. Si estudias cuidadosamente el esquema presentado, podrás ver que ella comienza por los primeros 11 aminoácidos de la región líder del gen 10 (éste gen codifica la región líder de la proteína principal de la cápside del bacteriófago T7).
El plásmido pET-3 contiene también el terminador del bacteriófago T7 (T T7).


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vector pKK240-11


ATG y sitio de restricción Nco I
Además de un promotor bacteriano, el segundo factor más importante para exprimir un gen eucariota en una bacteria, como la E. coli es el de tener un sitio eficiente de fijación al ribosoma. Cuando se busca la expresión de un gen procariota, el sitio de fijación del ribosoma de ése gen es a menudo suficiente. Se procede entonces a clonar el gen de interés a lo largo del promotor (fuerte é inducible), utilizando un sitio de restricción en 5' de la secuencia Shine-Dalgarno, para obtener niveles de expresión elevados.

El sitio de fijación al ribosoma se puede mejorar y hacer eficiente si se desea la expresión de gens eucariotas y procariotas con sitios de fijación poco eficientes. Esto se realiza insertADNo el gen de interés en un plásmido, como el pKK240-11, y asegurándose que el segundo codón de ése gen siga al codón ATG del vector.
El ATG está incluído en el sitio de restricción NcoI. El plásmido se digiere entonces por NcoI y la extremidad adhesiva se rellena con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli.

A la extremidad derecha de éste arreglo se le puede añadir un fragmento de ADN que comienze por el segundo codón del gen a exprimir. Este fragmento es fácilmente preparado por PCR utilizando la Pfu ADN polimerasa. El vector pKK240-11 poseé un promotor tac y un sitio de fijación de ribosoma del gen LacZ y también los terminadores de transcripción T1 y T2 del gen 5S de E. coli.




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vector pQE de Quiagen
(Etiqueta Histidina)

Otra técnica de purificación de proteínas recombinantes se basa en la observación de que un segmento de una proteína constituído de una serie de 6 histidina se une a metales de transición mediante el uso de queladores.

La secuencia codificante de la proteína se clona an un plásmido arriba ó abajo de una secuencia que codifica la 6 Histidina. Las proteínas eucariotas producidas pueden representar hasta 50 % de las proteínas celulares totales. Las bacterias son lisadas y éste extracto bacteriano se deposita en una columna de resinas Ni++-NTA (Nitrilo-Tri-Acetic Acid). Los iones Ni++ complexados en los cuatro puntos de coordinación por la resina tienen una alta afinidad por las 6 histidinas consecutivas fijadas a la proteína.

La resina puede fijar hasta 5 mg proteína/ml de resina. La afinidad de la resina Ni++-NTA por las 6 Histidina es más grADNe que la producida entre antígeno-anticuerpo. Por lo tanto no es influenciada por agentes denaturantes como la úrea 8M ó el hidrocloruro de guanidina 6M. Debido a que hay sólo un número limitado de proteínas (HNF6 presentan 8 histidinas consecutivas) que de manera natural se unan a metales de transición, las proteínas fusionadas de secuencia 6 histidina pueden ser purificadas en una sóla etapa. La proteína pura se la obtiene añadiendo imidazol como agente competidor. El nivel de recuperación es alto, aún si sólo constituye el 1% del total de proteínas provenientes de la lísis original.
La secuencia de las 6 Histidina no tienen carga a pH fisiológico y sólo afectan muy raramente la conformación de la proteína a la cual se ligan: preservADNo la función de la otra proteína. Además no interfiere en su secreción y es poco immunogénica en la mayoría de las especies, salvo en el mono.

 

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c. cuerpos de inclusión

Una concentración elevada de proteínas en la E. coli provoca a menudo la aparición de gránulos citoplasmáticos ó cuerpos de inclusión insolubles. Después de la lísis de bacterias, los cuerpos de inclusión se recuperan mediante centrifugación y se lavan con detergentes (Triton X-100) y de EDTA. Para cada proteína es necesario adapatar un protocolo apropiado. A menudo se utiliza el hidrocloruro de guanidina (5 à 8 M), la úrea (6 a 8 M), el SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), un pH alcalino ó una mezcla de acetonitrilo y de propanol.

CuADNo la proteína es por fin solubilizada, se debe encontrar la manera adecuada de eliminar el agente denaturante y la proteína recupere su conformación original.
Ejemplos de proteínas de mamíferos expresadas en E. coli

Algunas proteínas de eucariotas, como la insulina y la hormona del crecimiento humana son exprimidas de manera eficiente y con poco costo en microorganismos.


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d. Ejemplos

a. La insulina

El problema de la insulina:
El primer medicamento producido por ingenría genética y con la primera licencia de ésta clase, es la insulina humana, destinada al tratamiento de la diabétes. Este producto reemplazó a la insulina extraída del páncreas del cerdo y la vaca. A pesar de que ésta molécula es biológicamente activa en el hombre, su secuencia en aminoácidos no es idéntica a aquella de la molécula humana. Es por ésto que ciertos pacientes producen anticuerpos contra ésta insulina.

pre-pro-insulina:
La insulina regula el metabolismo de los azúcares y es normalmente secretada en la sangre por las células del páncreas. Es una proteína de 108 aminoácidos, con una secuencia hidrofoba ó secuencia señal (24 aminoácidos) que le permite atravezar las membranas intracelulares y que se conoce como pre-proinsulina.

pro-insulina y peptido C
A lo largo de su transporte, la secuencia señal de 24 aminoácidos se separa de la cadena del polipéptido, formando la pro-insulina, que se almacena en vesículas que se lian a las membranas de las células pancreáticas. La pro-insulina es entonces replegada ó comprimida como una letra G, los 2 extremos del chorro sostenidos juntos por 3 puentes disulfuros y entonces transformada en insulina dentro de las vesículas pancreáticas mediante la excisión enzimática de un segmento polipéptidico de 33 aminoácidos conocidos como péptido
C.

insulina madura:
La insulina madura está formada de 2 cadenas distintas, una de 21 aminoácidos (la cadena A) y la otra de 30 aminoácidos (cadena B); unidas por puentes disulfuros iguales. La insulina no contiene cadenas sacarídicas.

La productción de la insulina usADNo E. coli :
El gen cromosómico de la insulina no puede ser utilizado para el clonado de la insulina en la bacteria, puesto que el codifica la pre-proinsulina que tiene una subdependencia de secuencias promotoras eucariotas y además contiene un intrón.

Es por eso que hubo que primero crear un ADNc de la proinsulina (sin secuencia señal ni intrón) que pudiera ser unido a la extremidad 5' de éste ADNc con un codón metionina (ATG) sintetizado químicamente (en efecto, la AUG de la insulina se encuentra dentro de la secuencia señal). Este ADNc se inserta en un plásmido que tiene un fragmento del gen lacZ compuesto de un promotor y de una parte de la secuencia codante de la ß-galactosidasa, creando así una proteína de fusión.

Es éste plásmido recombinado el que es introducido en la E. coli.



En la célula bacteriana, y bajo el control de secuencias de regulación del gen lacZ, de la ARNm es producido y traducido en proteínas constituídas una parte de ß-galactosidasa fusionada por la metionina suplementaria a la proinsulina. La insulina se obtiene tratando la proteína de fusión con bromuro de cianógeno, un reactivo que corta las uniones peptídicas junto a los residuos de metionina. La metionina no aparece en la secuencia de la proinsulina nativa. La insulina recombinada se repliega en una estructura tridimensional gracias a la formación de puentes disulfuro y el péptido C es cortado por proteasas dando lugar a la insulina humana pura.


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b. La hormona del crecimiento humano (hGH)


El problema de la hGH:

La producción de la hormona de crecimiento humano (hGH) en la E. coli es otro ejemplo. La hormona de crecimiento normalmente producida en la hipófisis, es una proteína de 191 aminoácidos que regulan el crecimiento y desarrollo. Al igual que la insulina, es una proteína no glicosilada. Inyecciones frequentes de ésta hormona estimulan el crecimiento en niños con su deficiencia permitiéndoles alcanzar una talla casi normal.

A la inversa del caso de la insulina, las hormonas del crecimiento de orígen animal son inefectivas en el hombre. Durante muchos años se la extrajo de la hipófisis de cadáveres humanos. Esta práctica además de peligrosa ocasionó la infestación de numerosos infantes con proteínas de tipo prión. Como la insulina, la hGH es normalmente producida bajo forma de una proteína precursora portadora de una secuencia señal aminoácido-terminal. La secuencia señal humana sinembargo no era reconocida por la maquinaria bacteriana de secreción. Es así que un gen híbrido se ideó y construyó de tal manera que la bacteria pudiera producir una versión casi normal de la proteína humana madura.

La production de hGH:
Un fragmento de ADN codificante de los aminoácidos 1 a 24 fueron sintetizados químicamente. A lo bajo del primer codón, un tripleto ATG se añadió. Por otro lado, un ADNc codificante de los aminoácidos 25 a 191 fueron obtenidos a partir de ARNm de las células hipofisarias humanas. Estos 2 fragmentos de ADN fueron clonados abajo del promotor lac en un plásmido. Este plásmido recombinado fué introducido en la E. coli donde la producción de la hormona de crecimiento humana se produjó.
El único inconveniente de ésta hormona recombinada era que comenzaba por una metionina que no era separada de la cadena restante del polipéptido por las enzima de la bacteria. Las bacterias sintetizaban entonces una proteína idéntica desde todos los puntos a la original; incluyendo actividad biológica, a partir de una metionina iniciadora, que no se separaba.

 


Además, la proteína debía seguir numerosas etapas para su purificación y la separación de las proteinas intracellulares de la bacteria en questión. Otra manera de producir la proteína en la bacteria entonces, era la de modificar la manera en que la proteína era secretada, ligando la secuencia codificante de la proteína hGH a la secuencia señal de una de las proteínas bacterianas secretadas. La hormona de crecimiento producida por éste método se secreta en el espacio periplásmico entre la membrana interna y externa de la bacteria con la eliminación frecuente de la señal peptídica por una proteasa bacteriana. La proteína producida es finalmente separada mediante alteraciones hipotónicas fuertes que rompen la membrana externa. La hGH producida de ésta manera no contiene metionina iniciadora puesto que una proteasa bacteriana periplásmica corta la señal.


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8. Expressión de genes clonados en E. coli
Jean-Pierre HERVEG y Maritza BARCIA-MACAY
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