NOTIONS DE GENIE GENETIQUE PRATIQUE (C)
par Etienne De Plaen
FARM2182 2004

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C. Clonage dans les plasmides

introduction
..................les plasmides et leur intérêt
..................structure du plasmide
..................transformation des bactéries
..................le réplicon
..................principe du clonage
..................qualités d'un vecteur
opéron lactose
inactivation par insertion
..................dans un gene de résistance
..................dans LacZa
clonage directionnel
déphosphorylation du vecteur linéarisé

Les plasmides et leur intérêt

En plus de leur chromosome de 4 millions de paires de bases, les bactéries possèdent généralement de petites molécules d'ADN circulaire dont la taille varie entre 1 kb et 200 kb (Fig. 8). Ces minichromosomes ou plasmides se répliquent et se transmettent indépendamment du chromosome bactérien, mais ils dépendent des protéines et enzymes de leur hôte pour leur réplication et la transcription de leurs gènes. Fréquemment, ils portent des gènes codant des enzymes qui dans certaines circonstances rencontrées dans la nature confèrent un avantage à l'hôte bactérien.

Fig. 8

Parmi ces propriétés avantageuses, il y a la résistance à des antibiotiques, la production d'antibiotiques, la dégradation de composés organiques complexes ainsi que la production de colicines, d'entérotoxines et d'enzymes de restriction et modification. Que ces gènes aient été trouvés sur des plasmides plutôt que sur le chromosome bactérien n'est pas dû au hasard. Comme ces gènes sont localisés sur des plasmides présents dans la cellule en plusieurs copies, leur nombre est beaucoup plus important que s'ils étaient localisés sur le chromosome. Comme l'ADN plasmidique est de beaucoup plus petite taille que n'importe quel ADN chromosomique même très fragmenté, il est facilement séparable du reste du matériel génétique..

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La structure du plasmide


On peut obtenir de grandes quantités de plasmide très pur. L'ADN plasmidique extrait d'une bactérie se trouve principalement sous une forme surenroulée. L'ADN surenroulé adopte une configuration plus compacte que l'ADN sous forme relâchée et il migre donc plus vite que ce dernier lors d'électrophorèse en gel d'agarose.

Fig. 9 a. Le plasmide circulaire, surenroulé et relaché.

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La transformation des bactéries

D'une façon générale, une cellule bactérienne donnée ne contient qu'un seul type de plasmide. Au laboratoire, il existe plusieurs méthodes pour introduire un plasmide dans une bactérie. On ajoute l'ADN plasmidique à des bactéries traitées au CaCl2 et on soumet l'ensemble à un bref choc thermique. Ce procédé est appelé transformation.

Le traitement des bactéries par d'autres sels que le chlorure de calcium et par des ions métalliques a permis d'accroître l'efficacité de transformation. Pour des plasmides de 3 kb, une transformation efficace génère environ 10+8 colonies/mg d'ADN plasmidique surenroulé. L'ADN peut également être introduit dans des bactéries par électroporation.

 

Ce procédé soumet les bactéries en suspension dans de l'eau à une différence de potentiel élevée pour ouvrir temporairement des pores dans la paroi des cellules. L'efficacité de transformation est inversement proportionnelle à la taille du plasmide. C'est la raison pour laquelle on préfère transformer des plasmides de petite taille.

Dans les meilleures conditions, les plasmides ne se maintiennent que dans une minorité de la population bactérienne. Pour identifier les bactéries transformées, on utilise des marqueurs de sélection portés par le plasmide. Les marqueurs de sélection les plus utilisés sont les gènes de résistance à des antibiotiques, comme l'ampicilline, la tétracycline, le chloramphénicol et la kanamycine. Par la suite, les bactéries transformées sont cultivées en présence de l'antibiotique de manière à éviter que la bactérie ne perde le plasmide qu'on y a introduit.

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le réplicon

L'élément génétique qui contrôle le nombre de copies du plasmide se trouve dans une région de l'ADN plasmidique qui inclut l'origine de réplication. L'origine de réplication et les éléments de contrôle associés définissent une unité génétique appelée « réplicon ».

 

Des plasmides à contrôle de réplication relâché se multiplient dans les cellules jusqu'à ce que chaque cellule ait en moyenne 10 à 200 copies du plasmide. Au contraire, des plasmides à contrôle de réplication strict (« stringent ») se répliquent en même temps que le chromosome bactérien et ne sont donc présents qu'à raison d'une ou de quelques copies par cellule.

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Le principe du clonage

Le principe du clonage est simple. Il consiste à insérer un segment d'ADN étranger dans une petite molécule capable de se répliquer de façon autonome. Ce type de molécule d'ADN est appelé un vecteur de clonage.

Un vecteur de clonage courant est le plasmide bactérien. L'ADN du plasmide est coupé par une enzyme de restriction et lié in vitro au fragment d'ADN étranger coupé par la même enzyme de restriction ou une enzyme qui donne des extrémités compatibles (Fig. 10-1).

Fig 10-1. production d'extrémités compatibles

Les molécules d'ADN résultantes sont transformées dans des bactéries (Fig 10-2).

 

Il est crucial de pouvoir distinguer (Fig 10-3) entre les colonies qui contiennent des plasmides recombinants et celles qui contiennent les non recombinants, c.-à-d. entre plasmides qui contiennent l'ADN étranger et plasmides qui se sont refermés sans prendre cet ADN étranger. Lorsqu'un transformant stable a été obtenu, la séquence est dite clonée.

Fig 10-3. sélection des bactéries transformées.

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Pour être de bons vecteurs de clonage,

-les plasmides doivent être petits et se répliquer sous contrôle relâché. La plupart des plasmides utilisés actuellement portent un réplicon dérivé du plasmide pMB1, qui a été isolé d'un échantillon clinique. Dans des conditions normales de culture, on trouve un minimum de 15 à 20 copies du plasmide portant ce réplicon dans chaque cellule bactérienne.

-ils doivent porter des marqueurs génétiques particuliers, comme des gènes de résistance aux antibiotiques ou le gène codant la ß-galactosidase.

 

-ils doivent porter un ou plusieurs sites de restriction uniques dans une région qui n'est pas essentielle pour la réplication des plasmides

-et si possible, ils doivent avoir des sites de restriction uniques dans des gènes codant des marqueurs sélectifs. Ces marqueurs sont inactivés lorsqu'on y insère un fragment d'ADN étranger.

 

 

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L'opéron lactose

Avant d'aborder les stratégies de clonage dans les plasmides, il est utile d'avoir quelques notions du fonctionnement de l'opéron lactose.

E. coli ne fabrique naturellement de grandes quantités d'une enzyme, la ß-galactosidase (ß-gal), que si le lactose, qui joue ici un rôle d'inducteur, est présent.

Le lactose n'est utilisable comme source d'énergie que s'il est hydrolysé en glucose et en galactose. C'est la ß-galactosidase qui catalyse cette réaction.

En étudiant des mutants incapables de moduler la production de ß-galactosidase, Jacques Monod et François Jacob à l'Institut Pasteur à Paris ont été amenés à postuler qu'il existe un répresseur spécifique capable de se fixer sur l'ADN tout près du gène codant la ß-galactosidase, à un site spécifique appelé opérateur (Fig. 11a).

C'est l'encombrement spatial induit par la fixation de ce répresseur à l'opérateur qui empêcherait l'ARN polymérase de débuter la synthèse de l'ARNm codant la ß-galactosidase.

Le lactose est un inducteur qui se lie au répresseur et qui l'empêche de se fixer à l'opérateur. En présence de lactose, le répresseur se trouve donc inactivé et l'ARNm lac est synthétisé (Fig. 11b).

Si on élimine le lactose du milieu, le répresseur recouvre sa capacité de se fixer à l'opérateur et d'éteindre la transcription du gène.

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Le gène de E. coli qui code la ß-galactosidase est adjacent à 2 autres gènes impliqués eux aussi dans le métabolisme du lactose.

Le gène Y code la lactose perméase, une protéine qui facilite spécifiquement l'entrée du lactose dans la cellule. Le second gène, le gène A, code la thiogalactoside transacétylase, une enzyme probablement impliquée dans l'élimination de composés similaires au lactose, mais que la b-galactosidase ne peut cliver en métabolites nutritifs.

L'ARNm qui code la ß-galactosidase, code aussi la perméase et l'acétylase. Ainsi, lorsqu'on ajoute du lactose au milieu de culture, les proportions relatives de ces 3 protéines augmentent conjointement.

Une série de gènes adjacents, transcrits en un seul ARNm et leur région de régulation est appelée opéron. En laboratoire, l'inducteur de l'opéron lactose utilisé est l'isopropyl-b-D-galactoside (IPTG) parce que ce composé n'est pas métabolisé.

Fig 11b

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insertion dans un gene de résistance

Il est possible de cloner un fragment d'ADN étranger dans un gène de résistance à un antibiotique. Cette méthode ne peut être utilisée qu'avec des vecteurs qui portent au moins 2 gènes de résistance. L'ADN plasmidique est coupé par une enzyme de restriction dont la séquence de reconnaissance est localisée dans un des 2 gènes de résistance, dans ce cas le gène tetr (Fig. 12 & 13). Le vecteur digéré par BamHI est ligué à un fragment d'ADN étranger dont les extrémités ont été générées aussi par l'enzyme BamHI.

Fig. 12 insertion dans le gène de résistance tet.

Le mélange de ligation est transformé dans E. coli. On sélectionne les transformants résistants au second antibiotique (dans cet exemple, l'ampicilline).

Fig. 13 discrimination des recombinés

Certaines des colonies qui poussent en présence d'ampicilline vont contenir des plasmides recombinants; d'autres vont contenir le vecteur seul qui s'est recircularisé. Pour discriminer les 2 types de transformants, on repique chaque colonie sur une boîte contenant de l'ampicilline et sur une boîte contenant de la tétracycline. Les bactéries qui survivent en présence de tétracycline devraient contenir un plasmide non recombinant tandis que les bactéries qui ne poussent pas en présence de tétracycline, mais qui poussent en présence d'ampicilline devraient contenir un plasmide recombinant. Cependant l'inactivation de gènes de résistance à un antibiotique par insertion d'un fragment d'ADN étranger est à présent beaucoup moins utilisée que l'inactivation d'un fragment biologiquement actif de la ß-galactosidase

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insertion dans LacZa

Les plasmides de type pUC (Fig. 14) portent un segment dérivé de l'opéron lactose de E. coli, comprenant le gène lacI qui code le répresseur, le promoteur, l'opérateur et une portion du gène lacZ qui code les 146 premiers acides aminés de la ß-galactosidase (lacZa). La synthèse de ce fragment de ß-galactosidase peut être induite par l'IPTG.

On a inséré, entre les codons 5 et 6 de la séquence lacZa, un polylinker (en français, « région à sites multiples de clonage ») qui est une courte séquence d'ADN contenant 8 à 16 sites de coupure uniques pour des enzymes de restriction.

Fig 14

Ce polylinker ne modifie pas la grille de lecture, mais donne lieu à l'introduction d'un petit nombre d'acides aminés dans la partie amino-terminale de la ß-galactosidase sans en changer les propriétés biochimiques.

The plasmid contains SP6 and T7 RNA polymerase promoters flanking a region of multiple cloning sites within the alpha-peptide coding region of ·ß-galactosidase.

T7 RNA polymerase transcription initiation site 1
SP6 RNA polymerase transcription initiation site 123
T7 RNA polymerase promoter (­17 to +3) 2981­3
SP6 RNA polymerase promoter (­17 to +3) 121­140
multiple cloning region 10­110
lacZ start codon 162
lacoperon sequences 2818­2978; 148­377
lacoperator 182­198
ß-lactamase (Amp r ) coding region 1319­2179

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Les vecteurs pUC sont transformés dans des bactéries qui produisent la partie carboxy-terminale de la ß-galactosidase (lacZDM15).

Quoique les 2 parties de la ß-galactosidase soient inactives séparément, elles peuvent s'associer pour former une enzyme active. On parle de complémentation alpha.

Les bactéries obtenues sont aisément identifiables parce qu'elles forment des colonies bleues en présence d'un substrat incolore, le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside (X-gal) qui est clivé par la ß-galactosidase pour donner une substance bleue insoluble et en présence d'IPTG.

Si on insère un fragment d'ADN étranger dans le polylinker, on détruit presque toujours la grille de lecture. Il n'y a donc plus de complémentation alpha.

Les bactéries portant les plasmides recombinants forment des colonies blanches, car la ß-galactosidase est inactive.

La mise au point de ce test de coloration a considérablement simplifié l'identification de bactéries portant des plasmides recombinants puisqu'il est possible de cribler des milliers de colonies visuellement (Fig. 14b).

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Clonage directionnel

La plupart des plasmides utilisés actuellement portent des polylinkers qui mettent à la disposition de l'expérimentateur plusieurs sites de restriction uniques. Il est donc souvent aisé de trouver des sites de restriction qui sont compatibles avec les extrémités du fragment à cloner.

Par exemple, le vecteur pUC19 peut être digéré par BamHI et HindIII et, après digestion, le grand fragment du vecteur peut être séparé du petit fragment correspondant à une partie du polylinker, par électrophorèse en gel d'agarose ou par chromatographie d'exclusion (Fig. 15).

Le vecteur peut être ligué à un fragment d'ADN étranger qui porte des extrémités compatibles avec celles générées par BamHI et HindIII.

Les molécules d'ADN circulaire obtenues sont transformées dans E. coli. Les bactéries transformées sont identifiées par leur capacité à résister à l'ampicilline. Etant donné qu'il n'y a pas de complémentarité entre les extrémités cohésives BamHI et HindIII du vecteur, la circularisation de celui-ci n'est pas possible. Le vecteur seul va être transformé avec peu d'efficacité si bien que la plupart des bactéries résistantes à l'ampicilline vont contenir un plasmide recombiné.

 

Tandis qu'un fragment cloné dans un site unique (par exemple, BamHI) va s'insérer dans l'une ou l'autre orientation, un fragment portant une extrémité BamHI et une extrémité HindIII cloné dans les sites correspondants du vecteur est inséré dans une seule orientation.

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Déphosphorylation du vecteur linéarisé

La T4 DNA ligase catalyse la formation d'un lien phosphodiester entre nucléotides adjacents seulement si un nucléotide porte un groupement 5'-phosphate et l'autre un 3'-OH.

On peut enlever les 5'-phosphates aux deux extrémités d'une molécule d'ADN double brin linéaire avec une phosphatase intestinale de veau, calf, (CIP) ou alcaline de crevette, shrimp, (SAP) : il n'y a plus de recircularisation du vecteur possible. Si on lie un fragment d'ADN avec des extrémités 5'-phosphate au vecteur déphosphorylé, on obtient alors une molécule d'ADN circulaire avec deux coupures (Fig. 16).

Ces coupures sont réparées lorsque le plasmide recombinant est introduit dans la bactérie. Comme un ADN plasmidique circulaire est transformé plus efficacement qu'un ADN linéaire, la plupart des transformants vont contenir des plasmides recombinants. A cause de leur facilité d'utilisation, les plasmides sont les vecteurs les plus employés en génie génétique.

Ils marchent mieux que n'importe quel autre vecteur lorsque la taille de l'ADN à cloner est inférieure à 10 kb. Pour des fragments de taille supérieure à 10 kb, l'efficacité de transformation devient trop faible. Si on veut malgré tout cloner des fragments de plus de 10 kb, il faut alors prendre des précautions pour limiter la recircularisation du vecteur.

fig. 16

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NOTIONS DE GENIE GENETIQUE PRATIQUE (C)
par Etienne De Plaen
FARM2182 2002

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