notions de génie génétique pratique: partie D, (farm 2182 2004)

Clonage dans les phages Lambda
par Etienne DE PLAEN PhD

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pratique de l' infection de bactéries par des phages

Introduction

Un ADN lineaire et des extrémités cos
le phage s'adorbe et injecte son ADN
L'ADN se circularise
Le phage peut lyser la bactérie (il est dit lytique)
Le phage peut ne pas lyser la bactérie (il est dit lysogénigue)

Construction de vecteurs lambda
Etapes du clonage dans le phage lambda

1. Préparation du vecteur
2. Ligation du DNA étranger
3. Encapsidation
4. Sélection des recombinants

Banques d'ADN génomique dans des phages
Tansgenic rodents for the study of mutation in animals (http://eden.ceh.uvic.ca/bigblue.htm).

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Un ADN lineaire et des extrémités cos

 

 

Dans les particules de phage, l'ADN est sous forme d'une molécule linéaire de 48,5 kb avec des extrémités simple brin complémentaires de 12 nucléotides ou « séquences cos » (Fig. 17a). Les séquences cos sont aussi appelées « extrémités cohésives », l'appariement étant facilité par la présence de 10 G ou C sur les 12 nucléotides de l'extrémité simple brin.

Fig. 17a --->

 

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le phage s'adorbe et injecte son ADN

Le bactériophage lambda s'adsorbe sur des récepteurs de la membrane externe de E. coli. Ces récepteurs codés par le gène bactérien lamB servent à transporter le maltose à l'intérieur de la cellule. Comme la synthèse de ces récepteurs est induite par le maltose et inhibée par le glucose, les bactéries qu'on veut infecter par des particules de bactériophage lambda doivent être cultivées dans un milieu contenant du maltose. L'adsorption des particules de phages sur les récepteurs est plus facile en présence d'ions Mg++ et se produit en quelques minutes à 37°C.

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L'ADN se circularise

 

Dans la bactérie, les extrémités cos du phage s'apparient pour former une molécule circulaire avec 2 coupures distantes de 12 nucléotides (fig 17c). Ces coupures sont rapidement réparées par la ligase de l'hôte bactérien. Le phage entame alors une des deux voies de réplication possibles : la voie lytique ou la voie lysogène (Fig. 18).

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Fig. 17c

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Le phage peut lyser la bactérie

Dans la voie lytique, l'ADN viral circulaire est répliqué de nombreuses fois.

Au cours de la phase précoce de l'infection, l'ADN circulaire du phage l se réplique dans les 2 directions à partir d'une seule origine. Ce mode de réplication est appelé forme de Cairns ou forme theta (fig 18a).

Fig. 18a


Fig. 18

Ensuite, ce mode de réplication est remplacé par la réplication en « rolling-circle » qui produit des longues molécules d'ADN linéaire constituées de génomes de phage l liés bout à bout (fig 18b).

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Au cours de la phase tardive de l'infection, il y a transcription des gènes impliqués dans l'assemblage des têtes et queues de bactériophage et des gènes impliqués dans la lyse cellulaire. Les séquences cos du polymère de génomes de phage produit par la réplication en rolling-circle sont reconnues par le produit du gène A.

La protéine A découpe le polymère en monomères de phage lambda qu'elle introduit dans des particules virales. On appelle cette étape, l'encapsidation. De nouvelles particules de phage sont ainsi assemblées. La cellule bactérienne finit par lyser en relâchant de nombreuses particules virales (fig 18c).

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Dans la voie lysogénique

 

Dans une faible proportion de cellules infectées par le phage lambda, le cycle lytique s'arrête et la voie lysogène est activée (Fig. 20).

Le choix entre voie lytique et voie lysogène dépend d'un équilibre délicat entre les activités de toute une série de protéines de la bactérie et du bactériophage.

Dans la voie lysogène, une recombinaison se produit entre l'ADN circulaire du phage et le chromosome de E. coli grâce à une courte séquence appelée "att" commune au génome de la bactérie et à celui du phage (Fig 18).

Le phage inséré dans le chromosome bactérien s'appelle un prophage et la bactérie qui contient le prophage est dite lysogène. Le génome du phage est répliqué et transmis d'une bactérie à l'autre comme n'importe quel gène du chromosome bactérien. Au cours de la phase lysogène, le seul gène du bactériophage exprimé est le gène cI qui code un répresseur. Ce répresseur bloque la transcription précoce des gènes du cycle lytique et par conséquent bloque l'expression des gènes tardifs de ce cycle.

Le prophage reste intégré jusqu'à ce qu'un signal induise son expression. Si on expose la bactérie à des agents qui, comme la lumière ultraviolette, endommagent l'ADN, le répresseur cI subit un clivage protéolytique par la protéine bactérienne RecA. L'inactivation du répresseur permet la transcription des gènes précoces.

On observe, après induction, une réversion du processus de crossing-over qui conduit à l'excision de l'ADN de l qui entre alors dans une phase de multiplication lytique.

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ejercicio

gateway technology:


In phage lambda, the integration site is known as att P, in E. coli the site is att B. The att B site is short, only 25 bp. The att sites contain the binding sites for the proteins that mediate lambda recombination. The integration reaction (att B x att P) is mediated by the proteins integrase (Int) and host integration factor (IHF).

integration:
When integration occurs, two new sites are created, att L and att R, flanking the integrated prophage, with no loss of DNA sequence. All the att sites are alike in that they contain a 15-bp recognition sequence for the recombinase (integrase).

excision:
The reaction can also go in the opposite direction (excision). When att L x att R recombine (mediated by the proteins integrase, host integration factor and excisionase [Xis]), the lambda -DNA is excised from the E. coli genome, recreating the att B site in E. coli and the att P site in lambda.

Key points:
1. Site-specific recombination mediated by phage lambda recombination proteins.
2. The reaction is specific and directional:
att B x att P <=> att L x att R.
3. Each reaction is mediated by a different combination of enzymes.

The Gateway® reactions are in vitro versions of the integration and excision reactions. Your goal is to move your gene (or genes) from one vector backbone to another.

Let's first consider the LR Reaction for making expression clones.

1. Your sequence of interest (X) is cloned in an Entry vector that is transcriptionally silent, Kmr, and is flanked by two recombination sites (attL1 and attL2).
2. You want to move this sequence of interest to a Destination vector. It contains all the sequence information required for expression, and is Apr. This plasmid also contains two recombination sites (attR1 and attR2) that flank a gene for negative selection, ccdB.
3. You combine the two plasmid DNAs, each with sequences flanked by recombination sites that do not recombine with each other, but will recombine with sites resident on the other molecule.
4. LR Clonase™ is comprised of Int, IHF, and Xis; you are doing an in vitro version of the excision reaction.
5. Att1 and att2 sites confer directionality and specificity for recombination, so that only attL1 will react with attR1, and attL2 with attR2.
6. Two recombination events occur to make the expression clone, one between attL1 and attR1 and the other between attL2 and attR2.
7. The product of these two recombination events is the plasmid construct that you want and a by-product (labeled as the donor vector). The desired plasmid is under two forms of selection: antibiotic resistance and negative selection. Selecting for Apr eliminates the starting vector and the by-product; the presence of the negative selection marker eliminates the destination vector and co-integrate molecules.

Construction de vecteurs lambda

Construction de vecteurs lambda
vecteurs d´insertion et vecteurs de remplacement

On aurait pu croire difficile d'utiliser le phage lambda comme vecteur de clonage puisque son génome contient environ 60 gènes et de nombreux sites de restriction dans la partie du génome essentielle pour le cycle lytique. Cependant, le problème s'est simplifié lorsqu'on a trouvé que le 1/3 central du génome viral n'était pas essentiel pour la croissance lytique (Fig 17). Les vecteurs qui ont un seul site où un fragment d'ADN (0 à 10 kb) peut être inséré sans affecter la voie lytique sont appelés vecteurs d'insertion. Ceux qui ont une paire de sites qui permet d'éliminer un fragment central et de le remplacer par un fragment d'ADN étranger de taille voisine (9 à 22 kb) sont appelés vecteurs de remplacement.

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1. Préparation du vecteur

Dans le cas des vecteurs de remplacement, la digestion de l'ADN du vecteur par une enzyme de restriction appropriée produit trois fragments : un fragment correspondant à la partie centrale non essentielle (lysogénique) et deux fragments latéraux (lytiques, 20 ET 9 kb) appelés les bras du phage (Fig. 20).

Le bras gauche (± 20 kb) et le bras droit du phage (8 à 10 kb) peuvent être séparés du fragment central (± 13 kb) par centrifugation à travers un gradient de sucrose. Comme les extrémités cos du phage s'apparient aisément en présence de Mg++, cela revient souvent à purifier un fragment de ± 30 kb correspondant aux 2 bras du phage associés en éliminant un fragment de ± 13 kb correspondant au fragment central.

 

Lorsqu'on dispose de vecteurs du type EMBL3A, on peut également empêcher la religation du fragment central et des bras en digérant le phage par deux enzymes de restriction différentes très proches l'une de l'autre dans chacun des 2 polylinkers qui bordent le fragment central (Fig. 21).

 

Si on élimine, par une précipitation à l'isopropanol, les très courts segments d'ADN provenant de la digestion du polylinker, les bras du phage ayant des extrémités différentes de celles du fragment central ne pourront pas se lier l'un à l'autre en présence de ligase.

Fig. 21a: creating an non insertable central fragment

Fig 21b: Sal I selective insert ligation

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2. Ligation du DNA étranger

Les bras du phage sont mis en présence de fragments d'ADN étranger qui ont des extrémités compatibles avec ces bras. Le mélange est soumis à l'action de la T4 DNA ligase dans un très petit volume (10 µl) de manière à faciliter les liaisons intermoléculaires.

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T4 DNA Ligase catalyzes the joining of two strands of DNA between the 5´-phosphate and the 3´-hydroxyl groups of adjacent nucleotides in either a cohesive-ended or blunt-ended configuration. It is rovided with 10X Reaction containing 10mM ATP.

1-3u/µl........1 - 4........32,22 euros (promega)

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3. Encapsidation

Les ADN recombinants résultants sont encapsidés in vitro de manière à donner des particules de phage viables qui forment des plages de lyse dans un hôte approprié (efficacité : 10 +8 plages/ µg ADN de phage lambda intact). Environ 0,05% à 0,5% des molécules présentes dans la réaction de ligation peuvent être encapsidées dans des particules virales infectieuses.

Fig. 22a: location of head add tail genes

Fig. 22b: head assembly

Les extraits d'encapsidation sont préparés à partir de bactéries lysogènes infectées avec des phages lambda mutants. Ces mutations se trouvent dans des gènes nécessaires à l'assemblage des particules de phage : gène A ou gène E (Fig. 22a).
La protéine E est un des composants principaux de la tête du phage. Des mutants dans le gène E accumulent tous les composants de la capside virale (Fig. 23).
La protéine A est impliquée dans l'insertion de l'ADN de lambda dans la tête du phage et du clivage de l'ADN concatémérisé aux sites cos. Des mutants dans le gène A accumulent des têtes de phage vides.

Fig. 22c: body assembly

Les phages lambda mutants sont maintenus à l'état lysogène par le répresseur cI thermosensible, cIts857, lorsque les bactéries -hôte sont cultivées à 32°C. La croissance lytique du bactériophage est induite lorsqu'on augmente la température à 45°C, ce qui a pour effet d'inactiver le répresseur thermosensible.

Il y a en plus dans le génome des phages mutants une délétion des séquences att de manière à éviter l'encapsidation du phage endogène dans les extraits préparés à partir des cellules induites.

Des extraits sont préparés à partir de bactéries infectées avec ces phages mutants A- et E-. Le mélange de ces deux extraits complémentaires en présence d'ADN recombinant permet l'encapsidation de celui-ci dans des particules de phages viables (Fig. 23).

 

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4. Sélection des recombinants

Il n'y a que 60 % du génome viral qui est nécessaire pour la propagation lytique du phage. Le 1/3 central du génome peut être remplacé par de l'ADN étranger, mais la viabilité des phages diminue si l'ADN encapsidé correspond à > 105 % (51 kb) ou < 78 % (38 kb) du génome sauvage.

Si les deux bras du phage s'associent sans insertion du fragment d'ADN à cloner, la molécule formée par la fusion du bras gauche et du bras droit est trop petite pour être encapsidée et elle ne donne pas de phage infectieux.

Si les deux bras s'associent à un fragment d'ADN étranger de 10 à 20 kb, la molécule recombinante peut être encapsidée et donner naissance à un phage infectieux. La présence d'un phage est démontrée par la lyse des bactéries infectées qui produit des plages claires dans les cultures sur boîtes.

Certains vecteurs ont, dans le fragment central, un fragment d'ADN de E. coli qui code la ß-galactosidase. Après infection de bactéries lac-, ces vecteurs donnent des plages de lyse bleues en présence de Xgal et d'IPTG.

 

 

Si on clone de l'ADN étranger dans ces vecteurs, on remplace la majeure partie du gène ß-galactosidase par de l'ADN étranger ou on interrompt la grille de lecture de ce gène. On obtient alors des plages incolore lorsqu'on infecte des bactéries lac- en présence de X-gal

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X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside),
in conjunction with IPTG, is used to detect b-galactosidase activity to differentiate recombinants from nonrecombinants in cloning experiments using vectors containing the lacZ or lacZ a-peptide gene.
100mg (50mg/ml) 46,29 euros.

IPTG, (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside)
is an inducer of ß-galactosidase activity in many bacteria. Functioning as a lactose analog, IPTG induces ß-galactosidase activity by binding to and inhibiting the lac repressor. This product is used to differentiate recombinants from nonrecombinants in cloning strategies using vectors containing the lacZ or lacZ ß-peptide gene.
5 g 114,81 euros.

 

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Banques d'ADN génomique dans des phages

Le but de la construction d'une banque d'ADN génomique est de cloner le génome entier d'une cellule de mammifère dans un vecteur bactérien.

Il est dangereux d'utiliser des plasmides pour cloner des fragments d'ADN chromosomique. Les petits plasmides se répliquent plus facilement que les grands et sont donc sélectionnés aux dépens de ces derniers ; on perd donc progressivement des morceaux du fragment d'ADN cloné. En revanche, des fragments d'ADN de 10 à 20 kb sont stables lorsqu'ils sont insérés dans le phage lambda.

Pour construire une banque représentative du génome, on casse l'ADN de façon aussi aléatoire que possible. La fragmentation au hasard se fait par digestion partielle d'ADN chromosomique avec une enzyme de restriction qui reconnaît une séquence de 4 nucléotides de manière à obtenir des fragments d'ADN d'environ 20 kb (Fig. 24). Ces fragments sont isolés et insérés dans le phage l.
Les étapes de la construction de la banque sont les suivants:

1. préparation des bras du phage.

2. digestion partielle de l'ADN eucaryotique par Sau3AI ou MboI (ØGATC). Ces enzymes coupent en moyenne 1/ 256 nucléotides. Si des fragments de 20 kb sont obtenus par digestion partielle, alors on coupe en moyenne 1 site sur les 80 sites Sau3AI ou MboI possibles. On a alors une collection de fragments coupés au hasard qui peuvent être fractionnés sur gradient sucrose ou gradient NaCl.

3. ligation des bras du vecteur aux fragments d'ADN eucaryotique par leurs extrémités compatibles. Cela donne de longues molécules concatamériques qui sont encapsidées in vitro dans des particules de phages.

Fig. 24

4. Les phages recombinants obtenus sont amplifiés dans E. coli. La suspension de phages qui en résulte peut être conservée pendant des années.D'autres vecteurs tirent parti du fait que le phage lambda sauvage ne pousse pas dans des lysogènes portant le prophage P2. Ce phénotype est appelé Spi+, c.-à-d. sensitive to P2 interference. Si ces vecteurs perdent red et gam, deux gènes impliqués dans la recombinaison, ils poussent bien dans des lysogènes P2.

Plusieurs vecteurs ont les gènes red et gam sur le fragment central. On peut enlever le fragment d'ADN central contenant red et gam et le remplacer par un fragment d'ADN étranger: les phages recombinants poussent alors dans des lysogènes P2 de E. coli. Puisque les phages recombinants supplantent le vecteur non recombinant dans ces cellules, il peut sembler superflu de séparer les bras du phage du fragment central. Cependant, en pratique, on a observé que la purification des bras du phage augmente l'efficacité de clonage de fragments d'ADN étranger dans ces vecteurs.

 

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