introduction:


Grâce au clonage dans des vecteurs bactériens qui fournit l'ADN en quantité illimitée et au séquençage, on a pu examiner à l'échelle moléculaire les séquences qui sont impliquées dans le contrôle de l'expression des gènes. En comparant les séquences de nombreux gènes, on a identifié les promoteurs, les séquences de splicing, le signal de polyadénylation ou les sites de liaison pour des facteurs de transcription. Toutefois, pour progresser dans la compréhension de la structure et de la fonction des gènes, il faut disposer d'un moyen pour modifier la séquence des gènes et analyser l'effet de ces changements sur leur fonction.

On peut à présent créer in vitro des mutations spécifiques dans n'importe quelle partie d'un gène et évaluer les effets de ces changements en réintroduisant le gène muté dans un organisme vivant, qui exprime alors la protéine mutée.

Il y a deux grands types de mutagenèse : la mutagenèse aléatoire et la mutagenèse dirigée. Les méthodes de mutagenèse aléatoire génèrent des mutations n'importe où dans un gène tandis que la méthode de mutagenèse dirigée crée des mutations exactement où l'on veut. La meilleure méthode de mutagenèse dirigée est basée sur l'utilisation d'oligonucléotides de synthèse. Elle implique donc qu'on connaisse la séquence du fragment d'ADN à muter.

1. Mutagenèses dirigées « classiques »

Le concept de base est simple:

a. un oligonucléotide (primer) et une matrice
qui porte la mutation (rouge sur fond bleu) à introduire est apparié à une séquence cible de la matrice d'ADN non mutée. Un paramètre crucial pour le succès de la mutagenèse dirigée est de choisir cet oligonucléotide mutagène. Par rapport à la séquence normale, cet oligonucléotide va souvent différer par un seul nucléotide qui correspond à une mutation ponctuelle, mais il peut porter aussi des mutations plus complexes comme des insertions, des délétions ou des mutations affectant plusieurs nucléotides contigus.

b. la longueur minimale
d'un oligonucléotide de synthèse est définie par la complexité de la mutation. On introduit aisément des mutations ponctuelles avec des oligonucléotides de 25 bases. Des mutations plus compliquées nécessitent des amorces qui peuvent aller jusqu'à 80 bases, ce qui est proche de la limite supérieure des synthétiseurs automatiques. Il faut que les nucléotides qui ne s'apparient pas à la matrice (mismatches) se trouvent au milieu de l'oligonucléotide et non pas sur les bords de celui-ci.

c. Cet oligonucléotide
sert d'amorce à une polymérase qui initie une synthèse d'ADN in vitro. On produit ainsi un ADN double brin qui porte la mutation présente au départ dans l'oligonucléotide.

d. transformation de bactéries

2. Mutagenèse circulaire
(circular mutagenesis)

la mutagénèse:
Une méthode de mutagenèse dirigée très performante, souvent appelée « circular mutagenesis », sélectionne les séquences mutées avec l'enzyme de restriction DpnI .

On commence par préparer l'ADN double brin d'un plasmide recombinant et par commander deux oligonucléotides de 25 à 45 bases portant tous les deux la mutation qu'on veut introduire. Ces deux amorces ont le même point de départ et le même point d'arrivée sur chacun des brins complémentaires du plasmide.

PCR:
L'ADN du plasmide est dénaturé et amplifié par 12 à 18 cycles de PCR en présence de Pfu ADN polymérase, une polymérase d'Archaea. Quoique les oligonucléotides mutés ne soient pas parfaitement complémentaires de la séquence clonée, ils vont s'y apparier si la température d'hybridation n'est pas trop élevée, c.-à-d. 55°C. A la fin de l'amplification, on obtient un plasmide muté qui contient une coupure sur des brins opposés. Un petit nombre de cycles d'amplification et une grande quantité de matrice (1 à 10 mg) sont utilisés pour réduire le nombre de mutations indésirables qui pourraient apparaître pendant l'amplification.

Dpn I sectionne sélectivement les plasmides non mutés:
Il faut éliminer les 2 matrice non mutées de manière sélective si on veut éviter un bruit de fond de colonies transformées par le plasmide non muté. Cela se fait en traitant le produit amplifié avec l'enzyme Dpn I qui coupe la séquence méthylée, GMe6ATC. Elle coupe plus lentement de l'ADN hémiméthylé. DpnI va donc couper l'ADN plasmidique de départ parce qu'il a été produit dans une bactérie qui exprime la Dam méthylase, mais il ne va pas couper l'ADN non méthylé synthétisé in vitro. Dpn I va couper cependant un hybride ADN de départ non muté/ADN muté synthétisé in vitro. Les molécules d'ADN résistantes à Dpn I, principalement des plasmides mutés, sont récupérés par transformation dans E. coli. En fonction de la complexité de la mutation et de la taille de la matrice d'ADN, entre 15 % et 80 % des colonies transformées contiennent des plasmides mutés. La méthode marche avec n'importe quel plasmide de taille modérée, c.-à-d. moins de 7 kb. Cette méthode permet d'introduire des mutations ponctuelles, mais aussi des insertions ou des délétions.

Les vérifications: séquençage ou Southern analysis
On vérifie la présence d'une mutation dans les plasmides extraits de colonies par séquençage ou par Southern analysis avec un oligonucléotide marqué. Cette deuxième méthode est utilisée lorsque le séquençage de quelques clones n'a pas permis d'identifier un clone muté. Les oligonucléotides synthétiques ne portent pas de groupement phosphate à l'extrémité 5'. On peut donc les marquer en présence de gamma32P ATP ou de gamma33P ATP et de T4 polynucléotide kinase. Cette enzyme catalyse le transfert du groupement phosphate-gamma de l'ATP sur l'extrémité 5'-OH de l'oligonucléotide. L'oligonucléotide qui a servi à effectuer la mutagenèse dirigée est marqué et utilisé comme sonde pour cribler l'ADN des clones recombinants. L'oligonucléotide marqué s'attache aux molécules d'ADN mutées et non mutées lorsque les conditions d'hybridation sont peu exigeantes, car il n'y a qu'une ou deux différences entre la séquence de l'oligonucléotide et celle du clone recombinant. On peut choisir une température à laquelle l'oligonucléotide ne va s'hybrider qu'aux molécules mutées et non aux molécules non mutées. Cette température est habituellement la température de fusion de l'oligonucléotide, Tm.

3. Mutagenèse par élimination d'un site de restriction unique
(USE mutagenesis ou unique site elimination mutagenesis)

deux nucléotides:
Dans cette méthode, deux oligonucléotides sont hybridés au même brin d'un plasmide recombinant dénaturé. Le premier oligonucléotide, l'oligonucléotide mutagène, introduit la mutation dans la séquence du fragment cloné tandis que le deuxième détruit un site de restriction unique dans le plasmide. Les deux oligucléotides phosphorylés en 5' sont utilisés comme amorces par la T4 ADN polymérase. Les coupures (nicks) qui subsistent dans le brin synthétisé sont soudées par la T4 ADN ligase.

les plasmides sauvage et hétéroduplex:
Le produit obtenu après cette première étape est un plasmide héteroduplex formé par l'association d'un brin du plasmide de départ et d'un brin nouvellement synthétisé qui porte la mutation, mais ne porte plus le site de restriction. La population de plasmides est donc composée de molécules non mutées, sauvage, qui n'ont pas été utilisées comme matrice pour une synthèse d'ADN et de molécules hétéroduplex qui ont perdu le site de restriction unique et acquis la mutation.

le plasmide sauvage est linéarisé
Dans une deuxième étape, on incube ce mélange de molécules d'ADN avec une enzyme de restriction qui coupe au site unique. Les molécules du plasmide de départ sont linéarisées tandis que les plasmides mutés résistent à la digestion.

transformation:
On transforme ensuite ce mélange de molécules circulaires et linéaires dans une souche de E. coli qui est déficiente dans la réparation des bases non appariées (E. coli BMH 71-18 mutS -). Comme l'efficacité de transformation de l'ADN linéaire est 10 à 1.000 fois plus faible que celle de l'ADN circulaire, la plupart des molécules du plasmide de départ ne sont pas transformées dans une bactérie. Les molécules d'ADN circulaire hétéroduplex commencent à se répliquer.

La réplication donne deux types de plasmides:
Puisque les bases non appariées ne sont pas réparées, le premier cycle de réplication donne un plasmide non muté qui porte le site de restriction unique et un plasmide muté qui ne le porte pas.

On linearise et on transforme à nouveau:
On extrait l'ADN plasmidique des bactéries transformées et on digère cet ADN une nouvelle fois par l'enzyme de restriction. Ensuite, on transforme l'ADN soumis à la digestion dans une souche de E. coli standard. Cette méthode permet d'obtenir des plasmides mutés avec une efficacité qui varie entre 5 et 30 %, selon la complexité de la mutation et l'efficacité de coupure par l'enzyme.

4. Mutagenèse dirigée utilisant la PCR

Comme on a remarqué qu'un non-appariement (mismatch) situé au milieu d'un hybride entre un oligonucléotide et sa séquence complémentaire n'affecte pas l'efficacité de l'amplification PCR, on introduit à présent des mutations grâce à cette technique.

a. avantages:
Les méthodes de mutagenèse dirigée basées sur la PCR offrent les avantages suivants :


haut rendement:
Le rendement de clones mutés est souvent si élevé qu'il ne faut pas sélectionner contre les matrices non mutées.

peu de structures secondaires:
Les températures élevées utilisées pour les polymérases thermostables diminuent le risque que la matrice d'ADN ne forme des structures secondaires qui réduiraient l'efficacité de la polymérisation d'ADN.

un seul tube:
Toutes les réactions se font dans un seul tube.


b. désavantages:

certaines polymérases font des fautes:
La polymérase thermostable peut introduire des mutations non voulues et ajouter des nucléotides en 3' des fragments d'ADN amplifiés. On peut minimiser le problème en utilisant la Pfu ADN polymérase plutôt que la Taq ADN polymérase.

réactions trop complexes:
Certaines méthodes nécessitent 3 ou 4 amorces et 3 PCR consécutives.

standardisation:
Les conditions de la PCR doivent être mises au point pour chaque nouveau couple d'amorces et pour chaque nouvelle matrice.

temps d'élongation trop long:
Il n'est pas toujours facile d'amplifier des fragments de plus de 2 à 3 kb.

Méthode du « mégaprimer » en un seul tube

La méthode du « mégaprimer » est la plus simple et la plus efficace des méthodes de mutagenèse utilisant la PCR.

La méthode utilise 2 PCR consécutives,
2 amorces externes (l et r) et une amorce interne portant la mutation (m). Les amorces externes peuvent être complémentaires de séquences du gène cloné ou de séquences du vecteur. L'amorce mutagène est orientée vers la plus proche des amorces externes de telle sorte que la longueur du mégaprimer soit réduite au minimum.

La première PCR
est réalisée avec l'amorce mutagène (m), une des deux amorces externes (l) et une matrice d'ADN non muté. Cette première amorce externe a une taille de 15 à 16 bases et un Tm calculé d'environ 45°C. L'amorce mutagène a une taille de 16 à 25 bases et un Tm semblable à celui de l'amorce externe. On programme donc la première PCR de manière à ce que la température d'hybridation soit basse. Le produit de cette réaction est un mégaprimer d'ADN double brin.

la seconde PCR
A la fin de la première PCR, on ajoute la deuxième amorce externe (r) qui a une taille de 25 à 30 bases et un Tm de 72 à 80°C. La seconde PCR se fait à une température d'hybridation élevée, habituellement 72 à 80°C. Les amorces utilisée au cours de la deuxième PCR sont dès lors le mégaprimer et la seconde amorce externe. Comme l'hybridation de la première amorce externe ne se fait pas à haute température, la matrice d'ADN non mutée n'est pas amplifiée efficacement au cours de la deuxième PCR. Le produit de la deuxième PCR est donc composé principalement d'ADN muté. L'efficacité de mutagenèse moyenne de cette méthode est de plus de 80 %. En plaçant des sites pour des enzymes de restriction dans les amorces externes, on peut utiliser facilement le produit de la PCR pour reconstruire un gène muté.

Mutagenèse dirigée par extension de recouvrement (overlap extension)

On a besoin de 4 amorces pour introduire une mutation spécifique par extension de recouvrement.

Une paire d'amorces (LM et L) est utilisée pour amplifier les séquences d'ADN qui contiennent l'endroit que l'on veut muter ainsi que la séquence en amont. L'amorces LM porte la mutation qu'on veut introduire.

La seconde paire d'amorces (RM et R) sert à amplifier les séquences d'ADN qui contiennent l'endroit que l'on veut muter ainsi que la séquence en aval. L'amorces RM porte aussi la mutation qu'on veut introduire.

Il faut qu'au moins 15 bases de l'amorce RM soient complémentaires de l'amorce LM.

Les deux paires d'amorces servent à amplifier des fragments d'ADN qui se recouvrent dans 2 réactions PCR séparées. La mutation se trouve dans la région de recouvrement et est donc présente dans les deux fragments amplifiés.

Les fragments qui se recouvrent sont mélangés, dénaturés et hybridés pour former des hétéroduplex qui peuvent être complétés par la polymérase.

Dans une troisième PCR, on amplifie un ADN complet en utilisant les 2 amorces externes R et L. La méthode est très efficace, mais elle nécessite 2 amorces mutagènes, 2 amorces externes et 3 PCR pour introduire une mutation.

Applications

Des mutations ponctuelles ou des petites délétions dans le promoteur du gène thymidine kinase du virus Herpes ont montré 3 régions essentielles : la boîte TATA (-25 à -30) et deux régions régulatrices riches en G,C (-50, -90). Lorsqu'on effectue des mutations ponctuelles dans une de ces trois régions, on observe une diminution importante de l'efficacité de la transcription. L'espacement entre ces régions est également important. Des délétions qui rapprochent la région -90 de la région -50 de même que des délétions qui rapprochent la région -50 de la boîte TATA conduisent à une réduction de l'efficacité de la transcription.
La mutagenèse dirigée peut être utilisée pour enlever ou créer un site pour une enzyme de restriction. Il est alors particulièrement simple de voir si la mutagenèse a marché. Une fois qu'un site de restriction a été mis en place, on peut fabriquer de nombreux mutants en insérant différents fragments synthétiques dans ce site de restriction.

Les codons de la séquence codante d'un gène peuvent être changés pour permettre la production de la protéine correspondante à des taux élevés dans d'autres organismes. Si on veut exprimer un gène dans E. coli, on peut muter certains codons en codons qui seront traduits très efficacement dans cette bactérie.
On peut étudier l'effet des mutations sur la structure et la fonction des protéines. Si la séquence codant une protéine est connue, on peut utiliser un oligonucléotide synthétique pour changer un nucléotide en un autre et donc un acide aminé en un autre. Il suffit ensuite de réintroduire le gène muté dans une cellule pour voir l'effet de ce changement d'acide aminé. Si la protéine étudiée est une protéine de membrane, on peut mettre en évidence les acides aminés qui sont importants pour l'insertion et l'ancrage de ces protéines dans la membrane. Il est parfois aussi intéressant de fabriquer des protéines chimériques en remplaçant une partie d'une protéine par la séquence homologue d'une autre protéine.

http://es.wikipedia.org/wiki/Mutaci%f3n
Historia:

El concepto de mutación fue introducido en 1901 por Hugo de Vries al observar cómo inesperadamente entre la descendencia de una planta llamada Oenothera lamarckiana había individuos gigantes.

Tipos de mutación:
Mutaciones moleculares o puntuales: Son la mutaciones que ocurren al alterar la secuencia de nucleótidos del ADN. Entre las mutaciones puntuales podemos distinguir:

1. Mutación por sustitución de bases: Se producen al cambiar la posición de un nucleótido por otro, por ejemplo, donde debería haber un nucleótido de citosina, se inserta uno de timina.
2. Mutación por pérdida de nucleótidos o delección: En la secuencia de nucleótidos se pierde uno y no se sustituye por nada.
3. Mutación por inserción de nuevos nucleótidos: Dentro de la secuencia del ADN se introducen nucleótidos que no deberían estar.
4. Mutación por inversión de nucleótidos: Se producen giros de 180 grados, es decir dos segmentos de nucleótidos de hebras complementarias se invierten y se intercambian.
5. Mutación por traslocación de pares de nucleótidos complementarios.

Mutaciones cromosómicas: Son las mutaciones que afectan a la secuencia de los hipotéticos fragmentos en que podría subdividirse transversalmente un cromosoma. Muchas de ellas son apreciables al microscopio gracias a la "técnica de bandas" con la que se confecciona el cariotipo. Sobre las mutaciones cromosómicas encontramos:

1. Mutación por inversión de un fragmento cromosómico.
2. Mutación por delección o pérdida de un fragmento cromosómico.
3. Mutación por duplicación de un fragmento cromosómico. Suelen estar asociadas casi siempre con delecciones en otro cromosoma.
4. Mutación por translocación de un fragmento cromosómico, es decir por un cambio en la posición de un fragmento cromosómico. La translocación puede ocurrir en un solo cromosoma, entre cromosomas homólogos o entre cromosomas diferentes.

Mutaciones genómicas: Son las mutaciones que afectan al número de cromosomas o todo el genoma.

1. Poliploidía: Es la mutación que consiste en el aumento del número normal de "juegos de cromosomas" . Los seres poliploides pueden ser autopoliploides, si todos los juegos proceden de la misma especie, o alopoliploides, si proceden de la hibridación, es decir, del cruce de dos especies diferentes.
2. Haploidía: Son las mutaciones que provocan una disminución en el número de juegos de cromosomas.
3. Aneuploidía: Son las mutaciones que afectan sólo a un número de ejemplares de un cromosoma o más, pero sin llegar a afectar al juego completo. Las aneuploidías pueden ser monosomías, trisomías, tetrasomías, etc, cuando en lugar de dos ejemplares de cada tipo de cromosomas, que es lo normal, hay o sólo uno, o tres, o cuatro, etc. Entre las aneuplodías podemos encontrar diferentes tipos de trastornos genéticos en humanos como pueden ser:
1. Trisomía 21 o Síndrome de Down o mongolismo que tienen 47 cromosomas.
2. Trisomía 18 o Síndrome de Edwars. También tienen 47 cromosomas.
3. Monosomía X0 o Síndrome de Turner.
4. Trisomía sexual XXX.
5. Trisomía sexual XXY o síndrome de Klinefelter.
6. Trisomía sexual XYY.

http://es.wikipedia.org/wiki/Mutaci%f3n
Causa de las mutaciones:

Mutaciones naturales o espontáneas: Son las que se producen en condiciones normales de crecimiento y del ambiente. Representan la base de la evolución.
Mutaciones inducidas: Son las mutaciones provocadas artificialmente por algún agente exógeno generalmente conocido llamado agente mutágeno. Entre los agentes mutágenos encontramos:

1. Agentes físicos:

1. Radiaciones ionizantes: Como los rayos ultravioleta, los rayos X, partículas alfa, beta y gamma de fuentes radiactivas como el radio, uranio, cobalto, rayos cósmicos que aumentan con la disminución de la capa de ozono.
2. Choque térmico.
3. Ultrasonidos de altísima energía.
4. Centrifugación masiva.

2. Agentes químicos:

Análogos de bases de ácidos nucleicos como la 5-bromouracilo, alcaloides como la cafeína, agentes que atacan al ADN (formalina), ácido nitroso, agentes alquilantes como el gas mostaza, colorantes de acridina (proflavina, acridina), carcinógenos (benzopireno), sulfato de cobre, ácido bórico, ácido fórmico, colchicina, uretano, drogas como el LSD, nicotina, edulcorantes como el ciclamato, peróxidos como el agua oxigenada y otros muchos más.

3. Agentes biológicos: Virus, bacterias.