NOTIONS DE GENIE GENETIQUE PRATIQUE (C)
par Etienne De Plaen
FARM2182 2004

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E. CLONAGE DANS LES COSMIDES

Introduction

taille des inserts des cosmide
role des séquences cos
c'est un plasmide avec des séquences cos

Etapes du clonage dans un cosmide à 2 sites cos
le clonage lui même

1. fragmentation de l'ADN génomique
2. fragmentation du vecteur à 2 cos
3. La ligation
4. l'encapsidation
5. L'insert se réplique comme un plasmide.

 

taille des inserts des cosmides

Dans le phage lambda, on peut introduire un fragment d'ADN eucaryotique de 15 à 20 kb. Cependant, certains gènes ont une taille supérieure à 20 kb. D'autre part, il est parfois nécessaire d'isoler et d'analyser une portion d'ADN chromosomique qui contient une famille de gènes. La famille des gènes de globine s'étend sur 70 kb et des familles plus complexes peuvent occuper plusieurs centaines de kb. C'est pourquoi on a mis au point le clonage dans les cosmides.

role des séquences cos

Comme nous l'avons vu précédemment, la molécule de phage lambda porte des extrémités d'ADN simple brin complémentaires, appelées extrémités cos. Au cours du cycle lytique de lambda, des centaines de copies de phage lambda forment une longue chaîne ou concatémère, chaque génome de phage étant lié au suivant par les séquences cos.

 

Les enzymes d'encapsidation clivent ce concatémère en fragments de la taille de lambda en reconnaissant deux séquences cos distantes de 38 à 51 kb et en introduisant chaque unité de phage lambda dans une tête de phage. Les séquences cos sont les seuls signaux nécessaires pour l'encapsidation d'ADN dans des têtes de phage.

c'est un plasmide avec des séquences cos ?

Un cosmide est un plasmide dans lequel on a cloné les séquences cos nécessaires à l'encapsidation dans des particules de phage lambda. Un cosmide a donc les caractéristiques suivantes:

-un gène de résistance à un ou plusieurs antibiotiques
-une origine de réplication de plasmide
-un ou plusieurs sites de restriction unique(s) pour le clonage (polylinkers)
-une ou deux séquences cos
-une petite taille : environ 5 kb

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un cosmide à 2 sites cos

Fig. 25a: clonage dans le cosmide c2RB

En l'absence d'ADN cloné, le cosmide peut être introduit dans E. coli et purifié comme un plasmide. Nous décrivons ici les étapes du clonage d'ADN eucaryotique dans un cosmide portant 2 sites cos, c2RB (Fig. 25). Ce vecteur est beaucoup plus facile à utiliser qu'un cosmide portant 1 seul site cos. Il est parfaitement adapté à la construction de banques d'ADN génomique.

 

Fig. 25b: clonage dans un cosmide

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1. fragmentation de l'ADN génomique

L'ADN eucaryotique de haut poids moléculaire est clivé partiellement par Sau3AI ou MboI de manière à obtenir des fragments de 35 à 45 kb. Ces fragments sont purifiés sur gradient NaCl. Afin d'éviter que les fragments utilisés pour le clonage portent une extrémité cohésive et une extrémité générée par cassure mécanique, il faut que la taille de l'ADN de départ soit au moins 4 fois supérieure à celle des fragments obtenus après digestion partielle, c.-à-d. >200 kb (Fig. 26).

Fig. 26a

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2. fragmentation du vecteur à 2 cos

Le vecteur portant 2 séquences cos est coupé par SmaI et déphosphorylé avec une phosphatase alcaline, puis clivé par BamHI. On obtient ainsi les 2 bras du cosmide. Chacun d'eux porte une séquence cos, une extrémité cohésive et une extrémité droite déphosphorylée.

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3. La ligation

L'ADN eucaryotique clivé par Sau3AI ou MboI est lié aux bras du cosmide qui ont une extrémité BamHI compatible. On obtient ainsi des molécules d'ADN recombinantes. La concaténation du vecteur seul, qui permettrait son encapsidation, est rendue impossible par traitement de l'extrémité SmaI à la phosphatase. Dans les molécules d'ADN recombinantes, l'origine de réplication du cosmide et le gène de résistance à l'ampicilline sont situés entre les deux séquences cos.

Figure 26 ------>

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4. l'encapsidation

 

L'ADN ligué est encapsidé in vitro. La protéine A du phage lambda reconnaît les séquences cos. L'ADN situé entre deux séquences cos est encapsidé in vitro dans des particules de phage matures. On sélectionne ainsi des molécules d'ADN recombinant dont la taille est de 38 à 51 kb. Comme le vecteur c2RB a une taille de 5,1 kb, on peut introduire dans ce cosmide 33 à 46 kb d'ADN étranger. Des molécules d'ADN trop petites ne sont pas encapsidées, même si elles possèdent des séquences cos à chaque extrémité.

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5. L'insert se réplique comme un plasmide.

Les particules de phage contenant cet ADN recombinant ne sont pas viables en tant que phages. Elles sont mises en présence de bactéries E. coli. L'ADN recombinant est injecté dans la cellule où il circularise par les extrémités cos. Il se réplique alors comme un grand plasmide et exprime la résistance à l'antibiotique. Comme, au cours de l'encapsidation, le vecteur c2RB perd le gène de résistance à la kanamycine, situé entre les 2 séquences cos, les bactéries contenant des cosmides recombinants ne devraient pas être résistantes à cet antibiotique.

De manière à éviter la recombinaison entre les séquences répétées des fragments d'ADN eucaryotique clonés, on infecte généralement des bactéries recA-. Le produit du gène recA est un produit bactérien majeur qui provoque une recombinaison en favorisant le transfert de brins entre molécules d'ADN. Malgré cette précaution, il semblerait que 1 à 2 % des cosmides recombinants soient très instables et subissent des réarrangements ou des délétions peu après avoir été injectés dans les bactéries.

Les banques de cosmides peuvent être conservées sous forme d'une suspension de particules de phage, mais elles sont plus souvent conservées sous forme d'une population amplifiée de bactéries infectées.

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