Plan
Introduction
Les enzymes de restriction de type II (EC 3.1.21.4)
Extrémités générées par les enzymes de restriction de type II
remplissage et rabotage des extémités sortantes

Isoschizomères et familles d'enzymes
Taille des fragments d'ADN obtenus
Méthylation de l'ADN (dam et dcm)

introduction

Dès 1953, on avait observé que lorsque des molécules d'ADN provenant d'une souche d'E. coli sont introduites dans une autre souche, elles ne sont que très rarement exprimées. En fait, l'ADN étranger est la plupart du temps rapidement coupé en petits fragments par une enzyme dite de restriction. Pour qu'il puisse se répliquer dans une nouvelle souche bactérienne, l'ADN introduit doit être protégé par une enzyme de modification qui ajoute des groupements méthyles à l'ADN.

En accord avec ces expériences dans E. coli, Hamilton Smith à l'Université Johns Hopkins s'aperçoit fortuitement que la bactérie Haemophilus influenzae dégrade rapidement un ADN étranger alors que son propre ADN reste intact. Cette découverte l'a amené à purifier HindII, la première enzyme de restriction coupant à un site spécifique et responsable de la dégradation de l'ADN étranger.

Depuis, on a appris que les enzymes de restriction se lient spécifiquement et clivent l'ADN double brin à des sites spécifiques appelés séquences de reconnaissance. Cette coupure peut se produire dans la séquence de reconnaissance ou à proximité de celle-ci.

Les enzymes ont été classées en 3 groupes. Les enzymes de type I et de type III ont à la fois l'activité de modification (méthylation) et l'activité de restriction (coupure) dépendante de l'ATP. Les enzymes de type I et III se distinguent par la manière de couper l'ADN. Elles ne sont pas très utilisées en génie génétique.

EC Numbers (cfr cours du Professeur J.B. Demoulin)

Enzymes:

EC 1 Oxidoreductases: catalyze redox reactions
EC 2 Transferases: transfer a functional group
EC 3 Hydrolases: catalyze the hydrolysis of various bonds
EC 4 Lyases: cleave various bonds without hydrolysis or redox
EC 5 Isomerases: isomerize within a single molecule
EC 6 Ligases: join two molecules with covalent bonds


EC 3.1.21.4
Common name:
type II site-specific deoxyribonuclease or type II restriction enzyme.
Reaction: Endonucleolytic cleavage of DNA giving specific ds DNA fragments with terminal 5'-phosphates.
These enzymes recognize specific short DNA sequences (restriction sites) and cleave within the recognition site.
_____________________

dsDNA = double strand DNA (ADN bicaténaire)
ssDNA = single strand DNA (ADN monocaténaire)
to cleave = couper, cliver
cleavage = coupure

Les enzymes de restriction de type II (EC 3.1.21.4)

Les enzymes de restriction de type II appartiennent à des systèmes binaires composés d'une endonucléase de restriction qui clive une séquence spécifique de nucléotides et d'une méthylase distincte qui modifie la même séquence de reconnaissance. Les enzymes de restriction coupent les deux brins d'une molécule d'ADN au niveau de séquences de reconnaissance particulières, typiquement 4 à 8 nucléotides avec un axe de symétrie d'ordre 2 (palindrome). Ceci génère, pour chaque brin, deux extrémités, l'une ayant un groupement 3'-OH, l'autre un groupement 5'-phosphate. Environ 150 enzymes de restriction ont été isolées à partir de plusieurs centaines de souches bactériennes. Les noms des enzymes sont des abréviations des souches bactériennes à partir desquelles elles ont été isolées (Figure ci-dessous). Un chiffre romain indique l'ordre de découverte des enzymes. Les enzymes les plus utilisées au laboratoire sont celles qui reconnaissent un site de quatre ou de six nucléotides.

Restriction sites are palindromes:

What's that ?

A palindrome is a word, phrase, verse, or sentence that reads the same backward or forward.
Exemple
1. a palindromic phrase: "a nut for a jar of tuna".
2. a restriction site:

The site recognised by Eco RI is
gaattc
cttaag

The site recognised by Hae III is
ggcc
ccgg

Extrémités générées par les enzymes de restriction

1.extrémité sortantes

extrémités 5' sortantes
Certaines enzymes, comme EcoRI, coupent chaque brin d'ADN en 5' de l'axe de symétrie et produisent des fragments à extrémités 5' sortantes.

EcoRI, première enzyme isolée de E. coli et première enzyme utilisée pour créer des molécules d'ADN recombinant, reconnaît une séquence de 6 nucléotides : GAATTC. Eco RI coupe la séquence entre g et a .
Les conditions utilisées pour la digestion ne favorisent pas l'appariement par liaisons hydrogène des 4 paires de bases situées entre les sites de coupure. Le segment d'ADN de départ se sépare en 2 fragments avec une extrémité simple brin de 4 nucléotides :

Si les fragments sont incubés dans des conditions qui favorisent la formation de ponts hydrogène, ces extrémités ont tendance à s'associer par appariement des bases; on les a donc appelées « extrémités cohésives » ou « bouts collants ».

extrémités 3' sortantes
D'autres enzymes, comme PstI, coupent chaque brin d'ADN en 3' de l'axe de symétrie et donnent des extrémités 3' sortantes. PstI reconnaît la séquence CTGCAG dans l'ADN double brin et la coupe entre le A et le G.

2. bouts francs (blunt ends)

D'autres enzymes, comme PvuII, coupent l'ADN au centre du site de reconnaissance et donnent des extrémités droites ou « des bouts francs »

PvuII reconnaît la séquence: CAGCTG. Il la coupe comme indiqué dans la figurede droite

remplissage et rabotage des extémités sortantes

La conversion d'une extrémité cohésive en une extrémité droite peut se faire avec le fragment *Klenow de la DNA polymérase I de E. coli (ou la T4 DNA polymérase) pour remplir les extrémités 5'-sortantes ou pour supprimer les extrémités 3'-sortantes. Ce que montre la figure de droite pour le fragment de Klenow est valable pour la T4 DNA pol.

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*The 5' -> 3' exonuclease activity of E. coli's DNA polymerase I makes it unsuitable for many applications. However, this pesky enzymatic activity can readily be removed from the holoenzyme. Exposure of DNA polymerase I to the protease subtilisin cleaves the molecule into a small fragment, which retains the 5' -> 3' exonuclease activity, and a large piece called Klenow fragment. The large or Klenow fragment of DNA polymerase I has DNA polymerase and 3' -> 5' exonuclease activities, and is widely used in molecular biology.
The Klenow fragment is also expressed in bacteria from a truncated form of the DNA polymerase I gene. The enzyme you purchase is almost certainly produced in this manner.
http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/
enzymes/klenow.html

 Isoschizomères et famille d'enzymes

 

En général, des enzymes de restriction différentes reconnaissent des séquences différentes. Cependant, plusieurs enzymes isolées d'organismes différents reconnaissent des séquences identiques. On les appelle isoschizomères. Ceux-ci ne coupent pas toujours la séquence reconnue au même endroit.


Une famille d'enzymes est caractérisée par le fait que tous les membres de cette famille produisent les mêmes extrémités, même si elles ont des séquences de reconnaissance différentes.

Taille des fragments d'ADN obtenus par coupure avec des enzymes de restriction

Si les sites de restriction sont distribués au hasard le long d'une molécule d'ADN, une enzyme qui reconnaît une séquence de 4 nucléotides coupe en moyenne 1/256 nucléotides tandis qu'une enzyme qui reconnaît une séquence de 6 nucléotides coupe en moyenne 1/4.096 nucléotides.

La digestion par EcoRI (séquence de reconnaissance de 6 nucléotides) d'une molécule d'ADN bactérien de 4 millions de paires de bases va donc donner environ 10 +3 fragments différents, tandis que la digestion totale d'ADN de mammifère va produire environ 10 +6 fragments.

De plus, la fréquence d'apparition d'un site dépend de sa séquence en nucléotides. Par exemple, l'enzyme NotI qui reconnaît un site de 8 nucléotides 5'-GCØGGCCGC-3' ne coupe que très rarement l'ADN des mammifères : il donne des fragments d'une taille moyenne de 1 à 1,5 millions de paires de bases. Cette enzyme est utilisée dans des travaux de cartographie physique de l'ADN.

Les fragments d'ADN de 200 paires de bases à 50 kilobases (kb) obtenus par coupure avec une enzyme de restriction peuvent être séparés par une électrophorèse en gel d'agarose (Fig. 4).

Les molécules d'ADN chargées négativement migrent dans le gel à une vitesse qui est fonction de leur taille ; les petits fragments migrent beaucoup plus vite que les grands.

Les fragments d'ADN sont visualisés par coloration au bromure d'éthidium, un colorant fluorescent qui s'intercale entre les bases de l'ADN. Ils apparaissent sous forme de bandes de couleur orange lorsqu'on place le gel sous lumière ultraviolette. La méthode permet de visualiser des bandes correspondant à des quantités aussi petites que 10 ng d'ADN.

Méthylation de l'ADN

 

La plupart des souches de E. coli contiennent deux enzymes qui méthylent l'ADN : la dam méthylase et la dcm méthylase.

La dam méthylase
La dam méthylase méthyle l'adénine dans la séquence 5'-GATC-3'. Les sites de reconnaissance de plusieurs enzymes de restriction telles que PvuI, BamHI, BclI, BglII, XhoII , MboI et Sau3AI contiennent cette séquence de même qu'une certaine proportion des sites reconnus par ClaI (1 site sur 4), TaqI (1 site sur 16), MboII (1 site sur 16) et HphI (1 site sur 16). Certaines enzymes ne coupent pas si l'adénine est méthylée. L'enzyme MboI ne coupe pas la séquence GATC si elle est méthylée tandis que l'enzyme Sau3AI reconnaît la même séquence que MboI et n'est pas affectée par la méthylation dam.

Trouver un isoschizomère insensible à la méthylation n'est pas toujours possible et si on veut que de l'ADN procaryotique soit coupé par BclI ou que tous les sites possibles de l'ADN procaryotique soient coupés par ClaI, XbaI, TaqI, MboII ou HphI, il faut préparer l'ADN à partir de souches de E. coli déficientes pour la dam méthylase (dam-).

La dcm méthylase
La dcm méthylase ajoute un groupement méthyle à la cytosine interne des séquences 5'-CCAGG-3' et 5'-CCTGG-3'. Une enzyme affectée par la dcm méthylation est EcoRII. On peut contourner le problème en utilisant BstNI qui reconnaît la même séquence que EcoRII, mais qui ne la coupe pas au même endroit. Si BstNI ne convient pas, on peut préparer l'ADN à partir de souches de E. coli qui sont dcm-.

E. coli K contient au moins 3 systèmes de restriction différents dépendant de la méthylation qui reconnaissent leurs séquences cible seulement lorsqu'elles sont méthylées : mrr (6-méthyladénine), mcrA (m5CG où m5C est la 5-méthylcytosine) et mcrB (Pum5C). Des fragments d'ADN méthylés à un de ces sites sont clonés inefficacement dans des souches sauvages de E. coli. Par exemple, comme les CG de l'ADN de mammifère sont largement méthylés in vivo (voir plus loin), l'ADN humain est restreint par mcrA.

lDes souches déficientes sont dèsors utilisées si on veut cloner de l'ADN méthylé.

L'ADN des eucaryotes contient en plus des 4 bases normales, la 5-méthylcytosine. La 5-méthylcytosine se trouve préférentiellement au niveau de paires CG quand la cytosine précède une guanine. Environ 70 % des paires CG sont méthylées au niveau de la cytosine dans l'ADN chromosomique eucaryotique. Or SalI reconnaît la séquence GTCGAC. Comme indiqué ci-dessus, dans l'ADN des eucaryotes, cette séquence est souvent méthylée en GTmeCGAC. L'enzyme SalI ne coupe pas si son site de reconnaissance est méthylé : SalI coupe donc très peu l'ADN des eucaryotes. Cependant, la propagation d'ADN de mammifère dans des souches de E. coli appropriées va conduire à une déméthylation des dinucléotides CpG. L'ADN de mammifère amplifié dans E. coli pourra donc être coupé par SalI.