notions de génie génétique pratique
F. CHROMOSOMES ARTIFICIELS
DE LEVURE (YAC) ET DE CHROMOSOMES ARTIFICIELS BACTERIENS (PAC ET BAC).
par Etienne De Plaen
FARM2182 2002

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plan
Chromosomes artificiels (AC):
.................de levure (YAC , Yeast Artificial Chromosomes)
.................dérivés du phage P1 (PAC , P1-derived artificial chromosomes)
.................basés sur le plasmide F de E. coli (BAC , Bacterial Artificial Chromosomes)

Résumé à propos des vecteurs de clonage

Chromosomes artificiels de levure (YAC)

 

Dans les organismes supérieurs, certaines unités génétiques sont plus grandes que 50 kb. Par exemple, le gène du facteur VIII chez l'homme qui code le facteur de coagulation du sang dépasse 190 kb et le gène défectif dans la dystrophie musculaire de Duchenne a une taille de 2.300 kb.

D'autre part, on s'intéresse de plus en plus à une cartographie globale du génome humain. Cette cartographie est d'autant plus rapide que les inserts sont plus grands.

On a développé un système de clonage qui est basé sur la construction in vitro de molécules d'ADN linéaires qui peuvent être introduites dans des levures Saccharomyces cerevisiae, où ces molécules se maintiennent sous la forme de chromosomes artificiels (YAC ou Yeast Artificial Chromosomes).

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Pratiquement, le système consiste à lier in vitro un plasmide et des fragments d'ADN de mammifère et à transformer ces molécules d'ADN recombinant dans des levures. Le plasmide porte les unités fonctionnelles principales des chromosomes de levure (fig.27a) :

-un centromère (CEN4) qu'on trouve sur chaque chromosome et qui assure une réplication stable et la précision de la répartition des chromosomes lorsque les cellules se divisent.

-une séquence de réplication autonome (ARS ou Autonomous Replicating Sequence) qui permet aux YAC de se répliquer comme des molécules autonomes, c.-à-d. sans s'intégrer dans un chromosome naturel de levure

-deux séquences indispensables à la formation des télomères (TEL). Ces séquences TEL se trouvent aux extrémités des chromosomes et permettent aux YAC de se répliquer sous forme de molécules linéaires

-des marqueurs de sélection métabolique

-des sites de clonage

fig 27a le palsmide pYAC2 --->

La digestion par BamHI et SmaI du vecteur présenté à la fig. 27 donne 3 fragments :
-un fragment qui peut être considéré comme un bras gauche de chromosome et qui porte le centromère, la séquence de réplication autonome et un télomère
-un bras droit de chromosome qui porte l'autre télomère
-un fragment central qui sépare les 2 télomères dans le plasmide circulaire.

Les fragments du vecteur digéré sont traités à la phosphatase alcaline de manière à empêcher leur religation.

 

Chacun des trois fragments est porteur d'un marqueur de sélection (vert) et chacun des 2 bras est porteur d'un télomère (bleu).

fig 27b: les bras du YAC

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L'ADN de mammifère non coupé doit avoir une taille supérieure à 1.000 kb. Cet ADN est obtenu par lyse de cellules enfermées dans de l'agarose à bas point de fusion, car ceci évite de casser les molécules d'ADN. Celles-ci y sont digérées partiellement ou complètement par une enzyme de restriction qui génère des extrémités droites. On isole des fragments de plus de >200 kb par électrophorèse en champs alternés. Ces fragments récupérés dans des blocs d'agarose sont liés aux bras du vecteur qui sont traités à la phosphatase alcaline pour empêcher leur religation. Cette ligation a lieu après avoir fait fondre les blocs d'agarose à 68°C, puis avoir refroidi la solution à 37°C.

fig 27c: la ligation

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Les produits de ligation sont ensuite transformés dans des levures avec une efficacité assez faible : le rendement est d'environ 300 clones par µg d'insert. Les inserts ont une taille de 250 à 1.500 kb. On sélectionne les levures contenant les YAC en utilisant les gènes de sélection présents sur chacun des bras du vecteur pYAC2. Les YAC se comportent comme des chromosomes de levure normaux et se répliquent chaque fois que la cellule entre en mitose.

Certains des chromosomes artificiels de levure obtenus sont instables : on y observe des petites délétions et des réarrangements qui pourraient être la conséquence des coupures dans les molécules d'ADN occasionnées au cours des manipulations.

D'autres YAC dits chimériques contiennent de l'ADN provenant de régions non contiguës du génome. Ces YAC chimériques peuvent représenter jusqu'à 50 % des YAC obtenus.

Il est évident que les clones réarrangés ou chimériques ne reflètent plus l'organisation réelle du chromosome. En outre, comme l'ADN de YAC doit généralement être séparé des autres chromosomes de levure par électrophorèse sur gel d'agarose en champs alternés, il est difficile d'obtenir l'ADN des YAC en quantités de l'ordre du microgramme.

 

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PAC

Chromosomes artificiels dérivés du phage P1
(PAC, P1-derived artificial chromosomes)

Suite aux problèmes rencontrés avec les YAC, on a mis au point dans les années 1990 un vecteur dérivé du bactériophage P1. Le vecteur pCYPAC1 (fig. 28a) permet de cloner des fragments qui ont une taille de 130 à 150 kb avec une efficacité qui est intermédiaire entre celle des cosmides et celle des YACs (1,5x10+5 colonies/µg insert).

fig. 28a: pCYPAC1

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fig. 28b: hydrolyse de pCYPAC1 par Bam HI et Sca I

L'ADN génomique à insérer dans le vecteur est digéré partiellement par Sau 3AI ou Mbo I et des fragments d'une taille de 150 à 250 kb sont purifiés par électrophorèse préparative en champs alternés. Ces fragments sont liés au vecteur qui a été coupé par Bam HI et Sca I puis déphosphorylé (fig. 28b).

Comme la transformation est d'autant plus difficile que la taille des molécules d'ADN augmente, le mélange de ligation est électroporé dans des bactéries E . coli.

 

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Si le fragment BamHI de 17 kb de pCYPAC1 se referme sans se lier au fragment d'ADN chromosomique, on reconstitue le gène SacB qui est toxique lorsqu'il est exprimé dans une bactérie. Le gène SacB de Bacillus amyloliquefaciens code en effet une enzyme, la levansucrase, qui catalyse l'hydrolyse du sucrose et transfère un fructose sur un lévane ou une autre molécule. Ceci est toxique pour E. coli. L'utilisation de ce gène toxique permet de sélectionner les clones recombinants.

Une fois introduits dans les bactéries, les PAC (P1-derived artificial chromosomes) s'y répliquent comme des plasmides à copie unique grâce au réplicon* plasmidique de P1 et semblent très stables. On sélectionne les clones recombinants en présence de kanamycine et de sucrose. L'ADN d'un PAC recombinant se prépare comme l'ADN d'un plasmide.

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*le réplicon est l'élément génétique qui contrôle le nombre de copies du plasmide se trouve dans une région de l'ADN plasmidique qui inclut l'origine de réplication. voir plamide.

Fig 28

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BAC
Chromosomes artificiels basés sur le plasmide F de E. coli (BAC)

Une alternative supplémentaire aux vecteurs de type YAC, mis au point comme les PAC dans les années 1990, est un système bactérien appelé BAC (Bacterial Artificial Chromosomes). Ce système est basé sur le facteur F ou facteur de fertilité de E. coli. Le facteur F est un plasmide conjugatif, c.-à-d. qu'il peut organiser avec une grande efficacité son propre transfert d'une bactérie dite mâle ou F+ à une bactérie dite femelle ou F- lorsque ces cellules sont en contact grâce à un « pilus sexuel ».

Le plasmide F a aussi la capacité de s'intégrer dans le chromosome bactérien et de s'en exciser. Un plasmide qui a cette capacité est appelé un épisome.

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Le plasmide F porte des gènes qui sont essentiels pour réguler sa propre réplication et pour contrôler aussi le nombre de copies du plasmide F. Les gènes oriS et repE régissent la réplication unidirectionnelle du plasmide tandis que les gènes parA et parB maintiennent le nombre de copies de celui-ci à 1 à 2 copies par cellule.

Le vecteur pBeloBAC11 porte ces gènes essentiels ainsi qu'un gène de résistance au chloramphénicol et la portion lacZa du gène b-galactosidase avec 2 sites de restriction HindIII et BamHI qui permettent le clonage de fragments d'ADN étranger (Fig. 29). Comme il y a 1 à 2 copies de ce plasmide par cellule, cela réduit la possibilité de recombinaison entre fragments d'ADN insérés dans le plasmide.

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L'ADN à cloner est digéré partiellement par HindIII, généralement dans des blocs d'agarose à bas point de fusion, de manière à obtenir des fragments de 150 kb à 250 kb. Ces fragments sont liés au vecteur pBAC digéré par HindIII et traité à la phosphatase alcaline. Comme dans le cas des PAC, le mélange de ligation est électroporé dans E. coli.

Les bactéries contenant des BAC sont sélectionnées en présence de chloramphénicol. L'efficacité est de 200 à 20.000 colonies par mg d'insert. En présence de X-gal et d'IPTG, l'inactivation du gène LacZa par insertion d'un fragment d'ADN étranger donne des colonies blanches.

Un autre vecteur BAC utilise le gène SacB décrit ci-dessus pour sélectionner les clones recombinants. La taille des fragments varie entre 160 kb et 200 kb. L'ADN des BAC est surenroulé et se prépare comme celui d'un plasmide. Les clones recombinants sont stables et peuvent être cultivés à long terme sans qu'on observe un réarrangement dans les séquences clonées.

Fig. 29

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Résumé à propos des vecteurs de clonage

Les plasmides sont très utilisés. Ils acceptent des fragments de taille moyenne (jusqu'à 10 kb), par exemple des sous-fragments de l'insert d'un phage ou d'un cosmide recombinant. La taille des fragments d'ADN étranger qui peuvent être acceptés par le bactériophage lambda (10 à 20 kb), les cosmides (35 à 45 kb), les PAC (130 à 150 kb), les BAC (160 à 200 kb) et les YAC (250 à 1.500 kb) en font les vecteurs de choix pour construire et amplifier des banques d'ADN génomique.

Les BAC et les PAC sont devenus les vecteurs principaux pour le séquençage du génome humain. Les ADNc (voir plus loin) sont clonés dans des plasmides ou des phages d'insertion.

 

NOTIONS DE GENIE GENETIQUE PRATIQUE (C)
par Etienne De Plaen
FARM2182 2002

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