notion de génie génétique
G. REACTION DE POLYMERISATION EN CHAINE (PCR)

 

La réaction enzymatique de polymérisation en chaîne (PCR) a été mise au point au milieu des années 1980 par Kary Mullis, ce qui lui a valu d'obtenir le prix Nobel en 1993. Comme le séquençage de l'ADN, elle a révolutionné la génétique moléculaire en permettant l'analyse rapide et peu coûteuse des gènes, y compris de ceux appartenant au génome complexe des mammifères.
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principe
..........les primers (amorces).
..........la denaturation.
..........hybridation des primers (amorces).
..........extension des primers (amorces).
..........les cycles successifs
ADN polymérases
synthèse d'oligonucléotides
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températures d'hybridation
rendement et contamination
clonage des produits PCR
quelques applications en recherche

1. Obtention de séquences spécifiques à partir d'ADN cloné
2. Analyse de mutations
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1. les primers

cette réaction permet d'amplifier un segment d'ADN situé entre deux régions de séquence connue. Pour effectuer cette réaction, il faut disposer de deux oligonucléotides qui correspondent à des séquences situées de part et d'autre du segment d'ADN à amplifier et sur des brins opposés (fig.30a).

 

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2. la denaturation

En présence d'un large excès des deux oligonucléotides et des quatre nucléotides, la matrice d'ADN double brin est d'abord dénaturée en la chauffant à 94°C. A cette température, les molécules d'ADN double brin se séparent complétement (fig.30b) pour fournir les simples brins servant de matrice à l'ADN polymérase.

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fig.30b: l'ADN est dénaturé à 94 ° C

3. hybridation des primers

Le milieu réactionnel est ensuite refroidi à une température qui permet aux deux oligonucléotides de s'hybrider (fig.30c) aux séquences qui leur sont complémentaires.

 

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4. extension des primers

Les oligonucléotides servent alors d'amorces (primers, en anglais) pour une réaction de synthèse d'ADN catalysée par une ADN polymérase.

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5. les cycles successifs

 

Des cycles de dénaturation, hybridation et synthèse d'ADN sont répétés de nombreuses fois. Comme les produits de chaque cycle d'amplification servent de matrices lors du cycle suivant, chaque cycle double la quantité de produit.

Le produit de cette réaction exponentielle est un segment d'ADN double brin dont les extrémités sont définies par les extrémités 5' des oligonucléotides utilisés comme amorces et dont la longueur est définie par la distance entre les deux amorces.

 

 

 

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Les premiers protocoles pour les réactions de polymérisation en chaîne utilisaient le fragment Klenow de l'ADN polymérase I de E. coli pour la réaction de synthèse d'ADN. Comme cette enzyme est inactivée aux températures utilisées pour dénaturer l'ADN, chaque cycle de synthèse nécessitait l'addition d'un aliquot frais d'enzyme.

Le problème fut résolu à partir de 1987 par l'utilisation d'une ADN polymérase thermostable (Taq I ADN polymérase) purifiée à partir de la bactérie Thermus aquaticus qui vit dans des sources chaudes à 70°C. Cette polymérase fonctionne de manière optimale à 72°C et résiste à une incubation prolongée à 95°C. La polymérase Taq peut donc être ajoutée au début de la réaction et fonctionne jusqu'à la fin du processus d'amplification. En outre, comme l'hybridation et la synthèse d'ADN sont effectuées à des températures élevées, on réduit fortement les hybridations des oligonucléotides avec des séquences qui ne sont pas strictement complémentaires.

La Taq DNA polymérase a une activité 5'->3' polymérase et 5'->3' exonucléase, mais elle n'a pas d'activité 3'->5' exonucléase. Elle possède en outre une activité terminal transférase qui ajoute un seul nucléotide, souvent un A, aux deux extrémités 3'-OH du fragment amplifié. Deux formes de Taq polymérase sont disponibles : une enzyme native purifiée de Thermus aquaticus et une enzyme produite grâce au génie génétique dans E. coli. Comme la Taq I DNA polymérase n'a pas d'activité 3'->5' exonucléase, elle n'est pas capable d'éliminer un nucléotide qui n'a pas été correctement inséré dans la chaîne en cours de synthèse.

On a montré que l'enzyme incorpore un nucléotide non apparié à la fréquence de 2/10.000 nucléotides par cycle. Le taux d'erreur observé après 30 cycles d'amplification est de l'ordre de 0,25 %. Ceci ne constitue pas vraiment un problème si l'on n'effectue qu'une analyse globale des produits d'une PCR, car les fragments amplifiés comportant la même erreur ne constituent qu'une toute petite partie de l'ensemble des molécules analysées. En revanche, l'incorporation erronée de nucléotides est un problème important si les fragments amplifiés sont destinés à être clonés. C'est d'autant plus dangereux si l'incorporation erronée s'est produite au tout début du processus d'amplification. Il est possible de résoudre partiellement ce problème en utilisant plus d'ADN matrice pour démarrer la PCR parce qu'alors on peut réduire le nombre de cycles d'amplification et du même coup le nombre d'étapes de synthèse de l'ADN.

Une autre amélioration est d'utiliser la Pfu ADN polymérase purifiée à partir de la bactérie Pyrococcus furiosus qui pousse à 100°C dans des sédiments marins géothermiques. Cette enzyme possède non seulement une activité 5'->3' polymérase, mais également 3'->5' exonucléase. Elle est connue pour avoir le taux d'erreur le plus bas : il est quatre fois plus faible que celui de la Taq ADN polymérase. Sa vitesse de polymérisation (550 nucléotides/min) est moins élevée que celle de la Taq ADN polymérase (2.800 nucléotides/min). Comme elle n'a pas d'activité terminal transférase, elle donne des produits PCR avec des extrémités droites.

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9. La recherche des ilots CpG méthylés

les ilots CpG (CpG islands)
L'ADN est fait de quatre nucléotides, l'adenine (A), la thymidine (T), la cytosine (C) et la guanine (G). Ils peuvent former 16 combinations (AA, AT, AC, AG, TT, TA, TC, TG, CC, CA, CT, CG, GG, GA, GT et GC). Ces dinucléotides sont souvent appelés NpN, N étant le nucléotide et p la liaison phosphodiester (ainsi, CpG signifie cytosine-phospho-guanine). La fréquence théorique de chaque dinucléotide dans le génome est approximativement de 6 %, (100/16). Chez l'homme, la fréquence mesurée de CpG estrêmement basse. On dit qu'il y a Suppression de CG ( CG suppression). La suppression de CG est caractéristique des génomes qui contiennent des cytosines méthylées. Il serait dû à la méthylation des cytisine qui induirait la disparition des CG.

Il y a des promoteurs dans les ilots CpG
Le phénomène de suppression des CG est généaralisé dans le genome humain, sauf dans de petites régions longue de 300-3000 bp. Ces régions sont connues sous le nom d'ilots CpG (CpG islands); elles représentent 1 % du genome. Ces régions échappent à la CG suppression des CpG parce que les cytosine n'y sont pas méthylées. Les ilots CpG se retrouvent pricipalement dans la région 5' des gènes exprimés. Plus de 60 des promoteurs humains se localisent dans de tels ilots.

L'abcisse dans schéma ci-dessus mesure 180 kb et représente la longueur du gène Rb, ce gène dont les mutations sont impliquées dans la cause de plusieurs cancers dont le rétinoblastome. L'ordonnée représente le % de CG dans chaque région du gène. La ligne pointillée indique 6%. Le pic de gauche correspond à la région promotrice du gène Rb.

inhibition des promoteurs dans les ilots CpG méthylé.
Si lepromoteur d'un gène se trouve dans un ilot CpG, la méthylation de l'ilot inhibe l'expression du gène qu'il controle. Cette inhibition est transmise aux cellules filles après mitose. La méthylation est donc une modification de l'ADN qui n'en altère pas la séquence tout en afffectant son expression. Des modifications de ce genre sont appelées des modifications épigéniques.

 

La méthylation est l'addition enzymatique de groupes méthyles sur des sites spécifiques de l'ADN, l'ARN ou des protéines. La méthylation d'une cytosine qui précède une guanine CpG) est la seule méthylation de l'ADN connue chez l'homme. Si chez l'homme 80 % des ilots CpG sont méthylés, ils le sont surtout là où la densité des CpGs est faible ou dans les séquences Alu. Là ou la densité des CpG est forte, les CpG ne sont pas méthylés (du moins chez l'homme jeune).

La méthylation est supprimée juste après la fécondation. Les profiles de méthylation de l'ADN sont établis très tôt dans le développement et se stabilisent jusqu'à la vielllesse. La méthylation inclut des DNA-methyltransferase et des de-methylases. Il existe des protéines transactivatrices qui induisent et d'autres qui inhibent la méthylation. Les protéines transactivatrices qui protègent de la méthylation se fixent sur les ilots CpG. Lors des mitoses, les ADN hémi-méthylés sont rapidement méthylés, conservant ainsi le profil de méthylation de la cellule mère.

Il est très important pour les promoteurs qui y sont inclus que les ilots CpG ne soient pas méthylées, parce que la méthylation inhibe l'expression des gènes. Ainsi, les promoteurs des gènes du chromosome X inativé et les gènes "imprinted" sont dans des ilots dont beucoups de CpG sont méthylés. Dans de nombreux cancers, on découvre des méthylations supplémentaires. Les gènes qui protègent des tumeurs (Rb, VHL, P16 et beaucouo d'autres) montrent parfois des profils de méthylation des ilots CpG dans lesquels sont inclus leurs promoteurs. Ces gènes se sont plus exprimés et le cancer peut se développer.


Il y a deux méthodes de détection des ilots CpG:

1. Dans la première on utilse les enzymes de restriction dont le site contient des CpG (Not I, Sac II, Eag I, BssH II etc.).
Lorsque l'ADN est méthylé, ces enzymes ne fragmentent pas l'ADN. Un fragment méthylés sera donc plus long que son homologue non méthylé. Ceci peut être mis en évidence par une sonde en Southern blot analysis

Le site reconnu par Not I est GCGGCCGC/CGCCGGCG. Not I ne coupe pas les sites méthylés. Une séquence qui contient un tel site et dans laquelle ce site est méthylé ne sera donc pas coupées par Not I. En Southern analysis, la sonde qui reconnait la séquence reconnaîtra donc une séquence plus longue:

2. Dans la seconde on utilise traîte une partie du DNA au bisulfite. Ceci transforme les cytosine en uracile. Le bisulfite ne transforme pas les cytosines méthylées. On commande deux jeux de primers, dans l'un les G sont remplaces par des A, dans l'autre les G restent des G. Le premier jeux est complémentaire aux séquences non méthylées, le second aux séquences méthylées et donc protégées contre l'action du bisulfite.

 

 

Jusqu'à il y a quelques années, la synthèse d'oligonucléotides était un processus long et il n'était pratiquement pas possible de synthétiser des oligonucléotides de plus de 20 résidus.

A présent, des machines programmables synthétisent facilement des oligonucléotides de plus de 40 bases. Le seul facteur limitant est que lorsque la taille augmente, le rendement de la synthèse diminue et qu'il devient alors nécessaire de purifier les produits de la réaction. La synthèse des oligonucléotides se fait sur un support solide inerte.

On commence par fixer le dernier nucléotide situé en 3' de l'amorce à synthétiser sur des billes de verre microscopiques qui sont introduites dans un tube capillaire où se déroule la réaction (Fig. 31a).

Fig. 31a: le dernier nucléotide

L'oligonucléotide est synthétisé à raison d'un nucléotide ajouté toutes les 3 à 5 minutes par un procédé en 3 étapes.

Dans un premier temps (Fig. 31b), le précurseur du nucléotide contenant la deuxième base (c.-à-d. l'avant-dernier nucléotide de l'amorce à synthétiser) est ajouté au mélange réactionnel. Le groupement 5'-OH de la base 1 réagit avec le phosphore 3' de la base 2. Ensuite, le phosphite trivalent instable produit est oxydé en phosphate plus stable. Enfin, le groupement dimethoxytritile (DMT) qui protège l'hydroxyle 5' du second nucléotide est éliminé. C'est la fin du premier cycle.

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Ce processus est répété et on ajoute alors le précurseur du nucléotide contenant la troisième base. A la fin de la synthèse, les oligonucléotides sont détachés de leur support et les groupements protecteurs des phosphates et des bases sont éliminés. Les oligonucléotides de synthèse ont toujours une extrémité 5'-OH.

Fig. 31a: l'ajout du nucléotide n-1

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La température d'hybridation choisie pour une PCR est généralement égale ou supérieure de 2 à 3°C à la température de fusion de l'oligonucléotide (en anglais, Tm ou melting temperature). Une première manière de calculer cette température est la suivante:

Tm = 2°C x (nombre de bases A, T) + 4°C x (nombre de bases G, C)
Cette formule est valable pour des oligonucléotides longs de 11 à 20 nucléotides et dans 1 M NaCl.

ex. : oligo CTC.AGA.ACC.ACC.GAG.CCC
Tm = 4°C x 12 G,C + 2°C x 6 A,T = 48 + 12 = 60°C

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Pour des oligonucléotides plus longs que 20 bases, on peut utiliser la formule suivante :
Tm = 16,6 log10(M) + 0,41 (Pgc) + 81,5 - Pm -B/L -0,65 (Pf)
où M est la concentration molaire de NaCl, en ne dépassant pas 0,5 M ;
Pgc est le pourcentage de G et C dans l'oligonucléotide (généralement, entre 30 et 70 %) ;
Pm est le pourcentage de bases non appariées (chaque pourcent de non-appariement fait diminuer la Tm de 1°C);

Pf est le pourcentage de formamide dans le milieu ;
B a une valeur de 675 (pour des sondes allant jusqu'à 100 bases) ;
L est la longueur de la sonde en bases.

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le thermocycler
La découverte d'ADN polymérases thermostables a permis l'automatisation de la PCR. On utilise des appareils qui sont des blocs chauffants que l'on peut programmer en fonction des différentes températures et des différents temps que l'on désire utiliser (Fig. 32a). Une fois les réactifs introduits dans cet appareil, la réaction se déroule sans aucune intervention manuelle.

Fig. 32a: un thermocycler pour PCR

le rendement
Le rendement d'une PCR est élevé. Théoriquement, après 20 cycles, on a amplifié 220 = 106 fois la quantité d'ADN de départ. Pratiquement, en partant de 1 pg (10-6 µg) d'ADN, on obtient 0,5 à 1 µg de produit après 30 cycles d'amplification.

nested PCR
Cette amplification de séquences d'ADN ne peut cependant pas se poursuivre à l'infini. Après 25 à 30 cycles d'amplification, la quantité d'ADN polymérase disponible devient limitante. Si on veut amplifier plus de 10+6 fois, le mieux est de diluer le produit de la première amplification 1.000 à 10.000 fois et de recommencer une nouvelle amplification avec une nouvelle paire d'amorces dont les séquences sont comprises dans le premier produit d'amplification (Fig. 32b). On peut ainsi atteindre des niveaux d'amplification de 10+9 à 10+10. L'utilisation de deux jeux d'amorces, que l'on appelle des amorces emboîtées (« nested PCR » en anglais), permet de réduire significativement le risque d'amplifier une séquence indésirable lorsqu'on effectue un nombre élevé de cycles.

Fig. 32b: les amorces emboîtées (nested)

évaluation du produit
On évalue la taille du produit PCR obtenu par électrophorèse sur gel d'agarose, suivie d'une coloration au bromure d'éthidium. La taille du segment amplifié est généralement de 0,2 à 2 kb, mais peut aller jusqu'à 15 kb.

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Si la séquence amplifiée est entièrement connue, on peut vérifier que la taille du produit PCR obtenu correspond à la taille attendue. On peut également vérifier, par digestion du produit PCR avec des enzymes de restriction, que les sites de restriction se trouvent à l'endroit prévu d'après la séquence. Même si cela demande un travail supplémentaire, il est souvent prudent de vérifier la spécificité des amorces utilisées en PCR en séquençant le produit obtenu (voir plus loin).

Pour le séquençage, les fragments d'ADN double brin doivent être purifiés par électrophorèse préparative ou sur une colonne d'exclusion de manière à éliminer les nucléotides et les deux oligonucléotides employés lors de la PCR.

l'ADN cible, nature, préparation et contrôle.
Pour la PCR, on utilise souvent de l'ADN génomique total extrait de cellules. Cet ADN peut être libéré en portant les cellules à ébullition et utilisé pour une PCR sans autre étape de purification. On peut amplifier des séquences d'ADN provenant de sources les plus inattendues, par exemple à partir de taches de sang séché depuis de nombreuses années, de peaux d'animaux conservées dans des musées, de plantes séchées ou à partir de momies égyptiennes vieilles de plusieurs milliers d'années. Malheureusement, ces molécules d'ADN sont très courtes du fait du processus de dégradation : la taille moyenne de l'ADN cloné après avoir été extrait d'une momie vieille de 4000 ans n'est que 90 paires de bases. Cet ADN humain peut aussi être contaminé par de l'ADN bactérien.
Comme la PCR est capable d'amplifier une seule molécule d'ADN, il faut se garder de toute contamination du milieu réactionnel par des traces d'ADN qui pourraient servir de matrices. Le danger est d'autant plus grand que l'on utilise deux paires d'amorces emboîtées. Les produits de réactions PCR sont des sources de contamination courantes puisqu'ils peuvent correspondre à 10+13 fragments amplifiés. De minuscules volumes comme les gouttelettes de l'aérosol provenant du cône d'une micropipette peuvent contenir un nombre important de fragments prêts à être amplifiés. L'idéal est d'avoir un jeu de pipettes réservé à la PCR, de porter des gants, d'aliquoter les solutions et d'inclure dans chaque PCR un contrôle qui contient tous les composants de la PCR, sauf l'ADN.

Une manière plus efficace d'éviter les contaminations par des produits PCR obtenus précédemment est d'utiliser l'uracile DNA glycosylase (UDG) de E . coli. Dans la bactérie, cette enzyme excise les uraciles incorporés dans l'ADN. Ces résidus peuvent apparaître suite à l'incorporation erronée de dUTP par l'ADN polymérase ou par déamination des cytosines. L'action de l'UDG laisse des sites sans bases dans une chaîne d'ADN simple brin ou double brin. Si on veut utiliser l'UDG pour éviter les contaminations en PCR, on commence par remplacer le dTTP par du dUTP dans le mélange de nucléotides utilisés par la polymérase. Tous les produits amplifiés contiennent alors de l'uracile (Fig. 33). Si on inclut ensuite l'UDG dans les PCR et qu'on laisse agir l'enzyme avant de commencer le premier cycle de dénaturation, l'UDG va hydrolyser le lien entre l'uracile et le ribose dans tous les produits PCR contaminants. Au cours de la première étape de dénaturation à 95°C, le lien phosphodiester situé en 3' des riboses sans bases va être clivé et l'UDG va être inactivée. La fragmentation du produit PCR contaminant va empêcher son amplification.

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Pour cloner les produits PCR, on peut utiliser l'ADN topoisomérase I, une enzyme qui coupe et recolle de l'ADN au cours de la réplication. La toposimérase clive un brin de l'ADN, permettant au brin clivé de se dérouler autour de l'axe du brin non clivé. L'enzyme soude ensuite les extrémités du brin clivé et se détache de l'ADN (fig. 34a).

fig. 34a: le mécanisme d'action de topo I

Son fonctionnement rappelle donc à la fois celui d'une enzyme de restriction et celui d'une ligase. La topoisomérase I du virus Vaccinia reconnaît la séquence 5'-(C/T)CCTT-3' sur de l'ADN double brin, et se lie de manière covalente au 3'-phosphate de la thymine située à la fin de cette séquence (fig. 34b).

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La séquence de reconnaissance de la topoisomérase est placée à chaque extrémité d'un plasmide linéarisé. Lorsque le vecteur est mélangé avec la topoisomérase, l'enzyme se lie de manière covalente au 3'-phosphate à l'extrémité du vecteur. Ceci protège le vecteur linéarisé de la dégradation par les exonucléases et empêche la religation du vecteur. On obtient ainsi un vecteur activé par la topoisomérase. Des produits PCR qui n'ont pas d'extrémité 5'-phosphate servent de substrat pour l'enzyme et sont liés au vecteur activé par la topoisomérase en 5 minutes à température ambiante.

fig. 34b: topo I dans le clonage plasmidique

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exercice

Fast, Effective Cloning of Taq-Amplified PCR

Products Description:


TOPO TA Cloning® Kits are designed for cloning PCR products directly from a PCR reaction in just 5 minutes. TOPO TA Cloning® Kits use a pCR®-TOPO® vector with covalently bound topoisomerase I for fast cloning and >95% recombinants.

The newest TOPO TA Cloning® Kit comes with a Gateway® (GW) entry vector, pCR®8/GW/TOPO® (http://www.invitrogen.com:80/Content/Online%20Seminars
/gateway/1.htm). This vector has:

· 3´-T overhangs for direct ligation of Taq-amplified PCR products
· att sites for rapid recombination into a variety of Gateway® destination vectors
· Novel GW primer sites, within the att regions, are located less than 55 base pairs from the PCR product insertion site for convenient sequencing
· Spectinomycin resistance gene for robust selection in E. coli
· EcoR I sites flanking the PCR product insertion site for easy excision of inserts

 

1. Obtention de séquences spécifiques à partir d'ADN cloné

Il est très pratique d'utiliser la PCR pour préparer l'ADN d'un fragment cloné dans un plasmide ou dans un phage (Fig. 35a et b). Il suffit de disposer d'oligonucléotides complémentaires de séquences du vecteur situées de part et d'autre du fragment cloné (fig 35a). Tout insert peut donc être facilement amplifié quelle que soit sa séquence. La PCR est aujourd'hui utilisée en routine pour identifier les clones contenant des inserts.

Comme les extrémités du segment amplifié sont définies par les oligonucléotides utilisés, la PCR peut servir à se débarrasser de séquences indésirables. Il est possible par exemple d'amplifier uniquement la grille de lecture d'un gène donné en utilisant des amorces complémentaires du début et de la fin de cette grille de lecture.

On peut également ajouter des séquences utiles, contenant par exemple un ou plusieurs sites de restriction, aux extrémités des fragments amplifiés. Il suffit pour cela d'introduire ces séquences supplémentaires en 5' des oligonucléotides choisis pour la PCR.

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2. Analyse de mutations

La PCR a été adaptée à la mise en évidence et à l'analyse des mutations dans de l'ADN eucaryote. Ces mutations peuvent être soit des délétions, soit des insertions, soit des remplacements d'un nucléotide par un autre (mutations ponctuelles). Cela peut se faire à partir du matériel isolé d'une cellule. Des délétions ou des insertions peuvent être détectées en testant la taille du produit amplifié. Si on veut mettre en évidence une mutation ponctuelle, il faut généralement séquencer le produit PCR puisque cette mutation ne va pas changer la taille du produit obtenu.

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notion de génie génétique
G. REACTION DE POLYMERISATION EN CHAINE (PCR)
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