plan

calcul du nombre de vecteurs recombinants à cribler
préparation de la sonde radioactive

1. megaprime DNA labelling (Fig. 36)
2. transcription in vitro (Fig. 37)

Criblage de banques de phages et de cosmides recombinants

1. etaler les phages ou cosmides recombinants (Fig. 38)
2. Répliquer les clones recombinants et libérer l'ADN de chacun d'eux
3. Hybridation et autoradiographie

Criblage de banques de PAC, de BAC et de YAC, (hybridation ou PCR.)

La marche sur le chromosome (Fig 43)

Southern blot (Fig. 44 & 45)

 

Calcul du nombre de vecteurs recombinants à cribler

 

Le nombre de vecteurs recombinants à cribler pour isoler une séquence donnée présente dans une banque se calcule par la formule :

N = ln(1-P) / ln(1-f)

où N est le nombre de vecteurs recombinants à cribler, P est la probabilité demandée de trouver un gène donné et f est la portion (sous forme de fraction) du génome clonée dans un vecteur recombinant.
Par exemple, pour avoir une probabilité de 99 % d'isoler une séquence donnée à partir d'une banque de fragments de 17 kb (banque de phages) d'un génome haploïde de mammifère (3 x 109 bp), il faut:

N = ln (1-0,99)
ln (1-(1,7. 10+4/ 3. 10+9)
N = 810.000 phages recombinants.

Si, dans la même banque de phages, on cherche une séquence unique d'un génome diploïde, par exemple un gène muté, alors N = 1.600.000. Dans le cas d'une banque de cosmides, le nombre de clones recombinants à cribler est moindre. Ceci est dû au fait que les cosmides acceptent de plus grands fragments d'ADN étranger (35 à 45 kb). Pour avoir une probabilité de 99 % de trouver dans une banque de cosmides une séquence unique dans un génome haploïde de mammifère, il faut obtenir 350.000 clones recombinants. Il en faut le double (700.000) si la séquence est unique dans un génome diploïde.

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Comme la taille du génome de E. coli est 1.000 fois plus petite que celle d'une cellule de mammifère, le nombre de clones recombinants à cribler pour isoler un gène de cette bactérie est de 800 pour une banque de phages et 350 pour une banque de cosmides.

Si on dispose d'une banque de YAC recombinants ayant en moyenne des inserts de 650 kb, il suffit de 20.000 clones pour avoir 99 % de chance de trouver un gène unique dans un génome haploïde de mammifère.
Pour cribler une banque de phages ou de cosmides, on peut utiliser un fragment d'ADN ou d'ARN capable de s'apparier avec la séquence du gène que l'on cherche à isoler. Un tel fragment d'acide nucléique est appelé une sonde. Cette sonde peut être l'ARNm correspondant au gène que l'on cherche. Le premier gène de mammifère qui a été cloné est le gène codant la b-globine du lapin parce que dans les réticulocytes, les ARNm de globine représentent 50 à 90 % de la totalité des ARNm. La sonde peut être également un fragment de gène permettant d'isoler un fragment d'ADN plus grand portant la totalité de la séquence du gène. La séquence de la sonde peut aussi être déduite de la séquence des acides aminés de la protéine purifiée correspondante. La sonde est habituellement marquée avec un isotope radioactif.

 

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Préparation de la sonde radioactive

1. Megaprime DNA labelling (Fig. 36)

La séquence d'ADN qu'on veut marquer est tout d'abord dénaturée pendant 2 minutes à 100°C. Puis on ajoute un nucléotide marqué au 32P (alpha32PdCTP), trois nucléotides non marqués et le fragment Klenow de l'ADN polymérase I de E. coli dans un tampon approprié. Le fragment Klenow qui a une activité 5'->3' polymérase va se servir d'une collection de nonamères (9 nucléotides) de séquence aléatoire pour initier une synthèse d'ADN sur la matrice d'ADN dénaturée en utilisant les trois nucléotides non radioactifs (vert) et le nucléotide radioactif (rouge). La réaction se fait à 37 °C pendant 5 à 10 minutes.

De très petites quantités d'ADN (20 ng) sont suffisantes pour cette synthèse conduisant à des activités spécifiques considérables : 109 dpm/µg d'ADN, c.-à-d. 70 à 80% d'incorporation.

On peut marquer des fragments d'ADN qui ne sont pas très purs, par exemple purifiés par électrophorèse en gel d'agarose ou provenant de mini-préparations de plasmides. On peut également utiliser un produit PCR.

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Préparation de la sonde radioactive

2. Transcription in vitro (Fig. 37)

Au début des années 1980, une méthode a été mise au point pour transcrire in vitro des fragments d'ADN clonés et synthétiser ainsi des ARN simple brin très radioactifs. On utilise pour cela des plasmides qui contiennent des promoteurs pour la SP6 ARN polymérase (provenant du bactériophage SP6 qui infecte Salmonella typhimurium), la T7 ou la T3 ARN polymérase (provenant du bactériophage T7 ou T3 qui infectent E. coli). Bien que ces polymérases aient des propriétés biochimiques communes, chacune d'elles a une très grande spécificité de reconnaissance pour le promoteur du bactériophage qui la produit. C'est ainsi que ces polymérases de bactériophage ne reconnaissent pas un promoteur d'un autre bactériophage, un promoteur bactérien, plasmidique ou eucaryotique. Ces promoteurs très spécifiques pour leur polymérase sont situés de part et d'autre d'un polylinker. On clone dans ce polylinker l'insert pour lequel on veut obtenir une sonde. Ensuite, en présence d'une des deux ARN polymérases, d'un ribonucléotide radioactif (a32P CTP) et de ribonucléotides non radiaoactifs, on synthétise une sonde ARN en se servant du plasmide comme matrice. Celui-ci est généralement linéarisé en aval de l'insert de manière à ce que la transcription s'arrête à la fin du fragment d'ADN cloné. L'ADN matrice est transcrit plusieurs fois avant d'être détruit par traitement avec une DNAase I. Les sondes ARN produites sont complémentaires d'un seul des 2 brins de la matrice, mais on peut utiliser les promoteurs situés de part et d'autre du fragment cloné pour produire indépendamment l'un et l'autre brin de la séquence clonée. Ces sondes offrent l'avantage de former des hybrides ARN :ARN ou ARN :ADN plus stables que les hybrides ADN :ADN obtenus avec une sonde ADN et donnent donc des signaux plus forts.
Ces promoteurs de bactériophages ont été également insérés dans des vecteurs tels que le bactériophage l ou le cosmide. Cela permet de préparer des sondes complémentaires d'une extrémité du fragment d'ADN cloné dans ces vecteurs.

Fig. 37 --------------->
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1. Etaler les phages ou cosmides recombinants (Fig. 38a)

On commence par diviser la banque de phages recombinants en aliquots de 20.000 à 50.000 particules de phage. Chaque aliquot est utilisé pour infecter des bactéries et on étale le mélange d'infection sur de l'agar, généralement dans des boîtes de 20 x 20 cm. L'étalement fournit quelques milliers de plages de lyse dans un tapis bactérien. Toute la banque est donc étalée sur 10 à 20 grandes boîtes.

Les bactéries infectées avec des cosmides sont étalées directement sur des filtres de nitrocellulose ou de nylon en présence de l'antibiotique approprié. Elles forment des colonies. On peut en mettre jusqu'à 100.000 sur une membrane de 20 x 20 cm. Une fois la banque étalée, on en prépare une copie ou réplique sur des membranes de nitrocellulose ou de nylon.;;

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Fig. 38a

 

 

 

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2. Répliquer les clones recombinants et libérer l'ADN de chacun d'eux

Cette étape permet de transférer une partie de chaque plage de lyse ou de chaque colonie bactérienne sur le filtre de nitrocellulose ou de nylon. Ce transfert s'opère de manière à conserver la répartition des plages de lyse ou des colonies bactériennes sur le filtre.

fig 38b

Pour répliquer les phages, on dépose une membrane sur la boîte avec les plages de lyse. Les phages présents à la surface vont coller à la nitrocellulose.

 

En solution alcaline, l'ADN va être libéré de la particule virale et s'attacher à la membrane, où il va former une image identique à celle des plages de lyse sur la boîte de départ. La nitrocellulose et le nylon ont une grande affinité pour l'ADN simple brin. Cet ADN peut être fixé à la membrane par cuisson à 80°C sous vide ou par irradiation avec de la lumière ultraviolette. La boîte de départ est conservée à 4°C en attendant le résultat de l'hybridation avec la sonde radioactive (fig 38b).

Pour répliquer les cosmides, on presse une deuxième membrane sur la première à la surface de laquelle ont poussé les colonies (Fig. 39). Lorsque les filtres sont séparés, un peu des bactéries de chaque colonie sont transférées sur le deuxième filtre. La configuration des colonies sur chacun des deux filtres est identique. Pour amplifier le nombre de cosmides dans chaque bactérie, on peut transférer un des deux filtres sur de l'agar contenant du chloramphénicol. Cette membrane sera ensuite traité au NaOH, qui lyse les bactéries et dénature l'ADN. Le filtre de départ est conservé à 4°C. Il peut également être transféré sur une boîte d'agar contenant 25% de glycérol et congelé à -70°C.

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Hybridation et autoradiographie

3. Hybridation et autoradiographie

Les filtres de nitrocellulose sont hybridés avec une sonde marquée au 32P. Les quantités d'ADN fixés à la nitrocellulose sont très faibles: une plage de lyse contient environ 106 particules de phage c.-à-d. 5 x 10-5 µg d'ADN et seulement une partie des phages se fixe à la nitrocellulose. Il faut donc détecter environ 10-5 µg d'ADN sur le filtre de nitrocellulose. La sonde s'hybride à l'ADN simple brin fixé à la nitrocellulose si celui-ci lui est complémentaire. Pour que cette hybridation puisse se faire, deux conditions doivent être satisfaites :

1. la concentration saline doit être suffisamment importante pour que soient éliminées les répulsions électrostatiques des groupements phosphate des deux brins, ce qui correspond à des concentrations en NaCl de 0.5 à 1M.

2. la température doit être assez élevée pour rompre les liaisons hydrogène qui se forment aléatoirement dans l'ADN simple brin et qui l'empêchent d'être parfaitement déroulé. Toutefois, la température ne doit pas être trop élevée, car les associations entre bases appartenant à deux brins d'ADN ne pourront pas se faire ou être maintenues. La température optimale pour la renaturation est de 20 à 25 °C inférieure à la température de fusion des deux brins ou Tm (temperature of melting). Elle est généralement de 65°C.

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L'évènement initial de la renaturation correspond à une collision. Ainsi, le taux de renaturation obéit à la loi d'action des masses et augmente avec la concentration d'ADN. Comme la concentration de la sonde est très faible (de l'ordre du ng/ml), il faut attendre environ 18 heures pour que la renaturation soit complète. Après cette période d'incubation, la membrane est lavée dans des solutions moins salines (0.3 à 0.015 M NaCl). La radioactivité est détectée grâce à un film sensible aux endroits où l'ADN radioactif s'est apparié avec l'ADN fixé à la membrane. L'autoradiographie est alignée avec le filtre de départ et la colonie ou la plage positive peut être repiquée et amplifiée. Généralement, à ce stade, on repique une région du filtre entourant le spot positif, c.-à-d. plusieurs phages ou cosmides, dont le positif. Il faut donc cribler ces phages ou ces cosmides une deuxième et même une troisième fois avant d'isoler le clone positif.

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Criblage de banques de PAC, de BAC et de YAC

Les clones recombinants des banques de PAC, de BAC ou de YAC sont répartis par un robot dans les puits de plaques à 96 puits à raison de 1 clone/puits. En cultivant chaque clone dans un puits, on évite de perdre ceux qui poussent plus lentement, comme cela arrive lorsque les banques sont amplifiées en culture de masse. Ces
banques peuvent être criblées par hybridation ou par PCR.

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Pour un criblage par hybridation, l'ADN de chacun des clones de la banque est extrait et déposé par un robot sur des filtres de nylon. Ces dépôts se font de manière à assurer une grande densité de clones par cm2 de membrane : sur un filtre de 460 cm2, on parvient à déposer l'ADN de 18.432 clones dans 2304 petits carrés repartis en 6 panels(Fig. 40a). Chacun de petits carrés contient l'ADN de 8 clones déposé en duplicat avec une orientation qui permet de les identifier (Fig. 40b). Ces filtres peuvent être criblés avec des sondes telles que des produits PCR ou des cosmides marqués avec un isotope radioactif. L'hybridation offre l'avantage de permettre l'isolement de séquences apparentées au gène que l'on étudie ; ces séquences ne sont souvent pas amplifiées avec des amorces PCR très spécifiques.

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Pour un criblage par PCR, la stratégie est de procéder à deux criblages successifs. Admettons qu'on dispose d'une banque de BAC de 96.000 clones répartis dans 1.000 plaques à 96 puits. On commence par constituer 50 « large pools » en rassemblant dans chacun d'eux les clones de 20 plaques à 96 puits, c.-à-d. 1920 clones (Fig. 41a and b). Avec chacun de ces « large pools », on prépare 38 « subpools », dont 10 correspondent au contenu de 2 plaques (une paire et une impaire), ainsi que 16 pools de lignes (8 de la plaque paire et 8 de la plaque impaire) et 12 pools de colonnes. On prépare l'ADN de chacun des pools, puis on commence par tester par PCR l'ADN de chacun des 50 « large pools ». Pour chaque « large pool » qui donne un produit PCR de la taille attendue, on teste ensuite par PCR l'ADN de 38 « subpools » de manière à identifier un ou plusieurs clones intéressants. Une stratégie semblable permet de cribler une banque de YAC par PCR (Fig. 42).

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La marche sur le chromosome (Fig 43)

Souvent, on veut analyser plusieurs centaines, voir plusieurs milliers de kb d'information contiguë le long du chromosome eucaryotique. Il est impossible d'avoir autant d'ADN étranger dans un vecteur recombinant. Cependant un clone recombinant, par exemple un phage, peut être utilisé pour en isoler un autre qui a quelques séquences en commun avec lui.

Fig 43

Pour cela, il faut isoler un petit fragment situé à une des extrémités du premier clone recombinant et utiliser ce fragment d'ADN comme sonde pour cribler à nouveau la banque de phages de manière à isoler un clone recombinant qui a ce morceau d'ADN et la séquence adjacente du génome.

Ce second clone recombinant est utilisé pour en obtenir un troisième, et ainsi de suite, de manière à obtenir une série de fragments qui se recouvrent l'un l'autre.

Bien sûr, il faut que le petit fragment d'ADN utilisé pour cribler à nouveau la banque soit une séquence unique dans le génome eucaryote. Il ne doit donc contenir aucune séquence répétitive. Chez l'homme, par exemple, les séquences répétitives Alu (qui contiennent le site de restriction pour Alu I, AGCT) sont au nombre de 1 million de copies par génome. Les séquences Alu sont dispersées dans tout le génome, c.-à-d. entre deux gènes et dans les introns de ces gènes.

La marche sur le chromosome peut être utilisée pour passer d'un cosmide, YAC, PAC ou BAC à un autre, pour autant que les inserts d'ADN génomique aient été préparés par digestion partielle. Des clones recombinants dont les séquences se recouvrent forment des contigs, c.-à-d. que l'ensemble de ces clones définit une région contiguë du chromosome. Dans le cas des YAC, l'analyse de ces recouvrements est rendue plus compliquée par la présence de clones réarrangés ou chimériques.

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Southern blot (Fig. 44 & 45)

Le transfert de type Southern (Southern blot) est un outil très efficace pour localiser les séquences intéressantes dans un fragment cloné. Pour cette manipulation, l'ADN du vecteur recombinant est coupé par une ou plusieurs enzymes de restriction et les fragments obtenus sont séparés en fonction de leur taille dans un gel d'agarose. Les fragments d'ADN sont d'abord dénaturés avec du NaOH. On applique ensuite sur le gel un filtre de nitrocellulose ou une membrane de nylon et l'on fait circuler un flux de solution saline (3M NaCl) vers la membrane. Les fragments d'ADN simple brin sont déplacés par ce flux du gel vers la membrane sur laquelle ils se fixent. On obtient donc une réplique du gel sur le filtre.

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Une sonde radioactive d'ADN ou d'ARN spécifique du gène à étudier est hybridée aux fragments d'ADN présents sur le filtre. La sonde s'hybridera spécifiquement avec les molécules contenant une séquence complémentaire. L'autoradiographie montrera une série de bandes indiquant le nombre et la taille des fragments qui présentent une séquence complémentaire à celle de la sonde. Cette technique peut être utilisée pour identifier des gènes apparentés à un gène qu'on connaît ou des gènes homologues provenant d'autres espèces.

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